超聲輔助酶解大米多肽的制備及其對酵母細胞增殖性影響

李素云，覃穎泉，謝冬梅，張華，李星科，王語遲

鄭州輕工業大學食品與生物工程學院（鄭州 450002）

大米蛋白是一種優質的植物蛋白，它富含人體所需的各種氨基酸，且組成平衡合理，與其他蛋白相比，大米蛋白還具有較高的生物價[1]，此外，大米蛋白不含致敏因子，是唯一免于過敏實驗的谷物蛋白[2]。將大米蛋白經過適度酶解可以制備生物活性肽，由于其分子量較小，更容易被機體吸收，所以其生理功能、營養特性和加工性能都比大米蛋白更為優越。因此通過常規酶解和超聲輔助酶解兩種方法制取大米多肽，將其用于培養酵母增殖，并對其增殖性進行對比試驗研究，從而探尋何種方式制備的大米多肽具有更佳的生理活性。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

大米蛋白，鄭州市天順食品添加劑有限公司，蛋白含量81.34%；堿性蛋白酶：酶活20萬 U/g，南京誠納化工有限公司；酪蛋白胨、酵母氮源、葡萄糖（分析純）、安琪干酵母、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉。其他試劑為國產分析試劑。

單頻聚能式單頻超聲，頻率28 kHz，無錫上佳；PHS-3 TC型pH計，上海天達儀器有限公司；Agilent 1100液相色譜，美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大米多肽的制備

超聲輔助酶解：在大米蛋白酶解前對大米蛋白溶液實施超聲，然后按照常規酶解方法酶解，酶解工藝按照前期試驗優化結果：大米蛋白溶液質量濃度為40 g/L，酶添加量為[E]/[S]=6%，溶液溫度為50 ℃、pH為8.5，酶解100 min后滅酶、離心，收集上清液，測定產物的大米多肽得率，考察超聲預處理大米蛋白對酶解效果的影響。

1.2.2 超聲輔助酶解工藝單因素試驗

取800 mL質量濃度為40 g/L的大米蛋白懸浮液在酶解前進行超聲預處理。超聲參數：超聲處理時間為5，10，15，20和25 min；超聲功率密度為33，45.5，51.8和65.8（W/L）；料液初始溫度為20，30，40和50 ℃。

1.2.3 超聲輔助酶解工藝優化

基于單因素試驗，以多肽得率CR（%）為指標，選擇超聲功率密度、超聲溫度、超聲時間為影響因素，因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.2.4 分子量測量

采用Agilent 1100液相色譜系統，對制備的大米蛋白酶解液進行分子量分布測定。流動相組成為乙腈、水、三氟乙酸，比例為體積比45︰5︰0.1；進樣和洗脫流速均為0.5 mL/min；色譜柱采用TSKgelG2000（300 mm×7.8 mm），且柱溫保持在30 ℃左右；檢測波長：UV 220 nm；進樣量：10 μL。

1.2.5 培養基及培養條件的確定

大米多肽培養基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L大米多肽、pH 5.5；YPD培養基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固體培養基加20 g/L瓊脂粉）。酵母細胞培養在100 mL YPD培養基中，安琪酵母經2代活化后以1%接種量接菌于大米多肽培養基，在30 ℃、120 r/min的搖床培養24 h。

1.2.6 不同濃度大米多肽培養基對酵母細胞增殖影響

將大米多肽配成濃度為10～30 g/L的多肽溶液，測定多肽溶液對酵母細胞增殖影響。

1.2.7 多肽得率的測定

3.平均每個孵化器有注冊企業44個。數據顯示，孵化器平均場地面積26755.08 m2，共孵化企業1108個，平均每個孵化器孵化44個企業。其中，中科云智國家級科技企業孵化器場地面積最大，達到154000 m2，占所調查孵化器總面積的23%；蜂巢空間孵化企業數最多，達184個，占所調查孵化器企業總數的16.6%。松山湖創新科技園孵化器的孵化效率最低，擁有50000 m2面積，在所調查的25個孵化器中，排名第5位，僅僅只有2家注冊企業。

不同超聲輔助酶解的大米蛋白懸濁液在離心力為10 000（×g）的冷凍離心機上離心15 min，收集上清液。上清液中蛋白溶出量采用Folin-phenol法測定。多肽得率按式（1）計算。

式中：C表示可溶性肽含量，μg/mL；V表示樣品體積，mL；N0表示原料中總氮的含量，mg。

2 試驗結果與分析

2.1 超聲輔助酶解大米蛋白單因素影響結果分析

2.1.1 超聲功率密度對大米多肽得率的影響

在超聲頻率為28 kHz、超聲溫度為50 ℃、質量濃度為40 g/L、工作間歇比為2︰2（s/s），超聲時間為10 min的條件下進行超聲預處理，考察不同超聲功率密度對多肽得率的影響，其結果如圖1所示。從圖1可以看出：隨超聲功率密度的增大，多肽得率先增大后減少，當功率密度達到51.8 W/L時，多肽得率達到最大值。原因是超聲功率過低，不能夠提供足夠的空化能量使蛋白顆粒得到充分撞擊，從而不利于蛋白的釋放；但超聲強度過大，游離出的蛋白質顆粒重新形成聚集，降低了與酶的接觸機會，導致多肽得率的降低[3]。因此，試驗選取的最佳超聲功率密度為51.8 W/L。

圖1 超聲功率密度對大米多肽得率的影響

2.1.2 超聲溫度對大米多肽得率的影響

在超聲頻率為28 kHz、質量濃度為40 g/L、超聲功率密度為51.8 W/L、工作間歇比為2︰2（s/s）、超聲時間為10 min的條件下，考察不同超聲預處理溫度對多肽得率的影響，結果如圖2所示。從圖2可以看出：隨著超聲預處理初始溫度的升高，多肽得率先增大后減小。產生這一現象的原因可能是：隨著超聲處理溫度的升高，料液中的物料顆粒碰撞加速，但當溫度過高時，液體媒介的蒸汽壓增加，料液中微小空化泡不能迅速成長-崩潰，空化作用強度減弱[4]。綜合考慮上述因素，選取50 ℃為最佳試驗溫度。

圖2 超聲溫度對大米多肽得率的影響

2.1.3 超聲時間對大米多肽得率的影響

在超聲頻率為28 kHz、超聲溫度為50 ℃、質量濃度為40 g/L、超聲功率為51.8 W/L、工作間歇比為2︰2（s/s）的條件下，考察不同超聲處理時間對多肽得率的影響，結果如圖3所示。從圖3可以看出：超聲預處理時間對大米蛋白多肽得率的影響是先增大后減少的。當超聲處理時間在5 min內時，大米蛋白多肽的得率呈急速上升，然后增速減緩的趨勢。當超聲時間大于15 min時，緩慢下降。其原因可能是：在較短的超聲時間（＜5 min）內，超聲處理有利于發揮其機械效應，使蛋白顆粒細化，增加酶與底物的接觸面積，有利于酶解反應的發生；但當超聲預處理的時間過長（＞15 min）時，超聲波和溫度累積的熱效應使蛋白的疏水性基團增加過多，進而發生聚集折疊，導致蛋白溶解量下降[5]，酶與底物的接觸面積減少，不利于酶解反應的進行。結果表明，超聲處理時間15 min為最佳處理時間。

圖3 超聲時間對大米多肽得率的影響

正交試驗結果見表2。按照極差大小，影響超聲輔助酶解大米蛋白多肽得率的三個因素的主次順序依次是：超聲處理＞超聲功率密度＞超聲時間。正交試驗得到的優化工藝為：超聲功率密度51.8 W/L、超聲溫度50 ℃、超聲時間15 min。在最優工藝下大米多肽得率為70.57%。

表2 超聲預處理大米蛋白輔助酶解正交試驗

2.2 兩種酶解方法對大米蛋白多肽得率和分子量分布影響研究

兩種酶解方法對大米蛋白多肽得率和分子量分布影響見表3和表4。從表3可以看出，超聲對大米蛋白預處理后，酶解初始反應速率增加迅速。原因可能是超聲波的機械效應、聲化學效應和堿液的化學作用有助于破壞分子之間的氫鍵、二硫鍵交聯，使大分子蛋白結構發生降解現象[6]。隨著酶解進行到40 min后，方法2的酶解反應速率逐漸變緩慢，與方法1的水解速度差異逐漸減少，到100 min時，水解度相差不大（表3），這是由于大多數的底物在100 min被酶解。但是在相同水解度條件下，與未超聲處理相比，方法2更能節省酶解時間。

表4是兩種酶解方法對大米蛋白多肽分子量分布影響。從表4可以看出，隨著水解時間延長到60 min，超聲酶解產物的相對分子量在小分子區間含量遠高于對照組，這與表3的研究結果相吻合，從而說明超聲輔助酶解能提高酶解效率，縮短酶解時間。

表3 超聲預處理對大米蛋白酶解效果影響（酶解100 min）

表4 超聲輔助酶解和常規酶解的酶解液分子量分布

2.3 不同濃度大米多肽培養基培養酵母細胞對酵母的影響

表5是不同大米多肽添加量培養基培養酵母24 h后所得的濕重結果。當大米多肽添加量為10～25 g/L時，所得的酵母細胞濕重隨著大米多肽添加量的增加而增加，超過25 g/L后增加量不再顯著，表明培養基中25 g/L的大米多肽添加量可以獲得較好的培養效果。

2.4 兩種酶解方法的大米蛋白多肽作為氮源對酵母細胞培養過程的影響

由圖4可知，在以25 g/L大米多肽作為氮源的培養基中，未超聲的菌液的吸光度增長較慢，達到穩定期所需時間較超聲培養基時間長。測量可知：超聲的大米多肽培養基中得到的酵母細胞量比未超聲培養基中得到的酵母細胞量多，大約是1.1倍，證明大米多肽可以促進酵母細胞的增殖，且與多肽分子量分布有關。

表5 酵母細胞在不同大米多肽添加量培養基中生長后的濕重

圖4 兩種酶解方法制備大米蛋白多肽作為培養基對酵母細胞生長影響

3 結論

試驗對超聲輔助酶解制備大米多肽工藝進行了優化，探討了常規和超聲輔助兩種酶解方法制取大米多肽對酵母增殖影響，得到如下結論：

1) 超聲輔助酶解最優工藝為：超聲功率密度51.8 W/L、超聲溫度50 ℃、超聲時間15 min。在最優工藝條件下，大米多肽得率為70.57%；在相同酶解時間內超聲輔助酶解液中多肽分子量分布在＜1 000 Da的比例更多。

2) 酵母細胞增殖能力隨著多肽濃度的增加而增強，當多肽達到25 g/L時，酵母增殖緩慢。

3) 超聲輔助酶解的大米多肽培養基中得到的酵母細胞量比未超聲培養基中得到的酵母細胞量多，證明大米多肽可以促進酵母細胞的增殖，且與多肽分子量分布有關。