離子液體雙水相萃取-HPLC測定飲料中的8種合成著色劑

胡貝*，李麗霞，李曉健，劉紅，黃偉，王林

湖北省藥品監督檢驗研究院（武漢 430075）

合成著色劑是在食品生產加工過程中，為改善食品色澤、增進人的食欲而添加的一類食品添加劑，大多以煤焦油中分離出的苯胺染料為原料制成[1]。合成著色劑由于其色澤鮮艷、性質穩定、著色力強、成本低廉等諸多優點，迅速得到廣泛的推廣與應用[2-3]。但合成著色劑不僅無任何營養價值，且絕大多數對人體有害，毒害作用不僅表現為一般毒性和致瀉性，有些品種還具有致癌性[1-2]。目前，國家標準[4]、進出口行業標準[5]及文獻報道[1]中測定食品中合成著色劑的前處理方法主要有聚酰胺粉吸附法、液-液萃取法、固相萃取法等，檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法。此外，QuEChERS-HPLC法[6]、QuEChERS-HPLC-MS/MS法[7]、SERS法[8-9]、離子液體分散液-液微萃取-HPLC法[10]等快檢方法也逐漸被應用于合成著色劑的檢測中，但這些方法大多會使用有機溶劑，存在污染。因此，尋求一種簡單、綠色、高效的檢測方法成為亟待解決的問題。

Gutowski等[11]2003年首次提出了離子液體雙水相（ILATPS）的概念，并研究了親水性離子液體[C4mim]Cl與K3PO4形成上相富集離子液體和下相富集磷酸鉀的雙水相體系。按照與離子液體形成雙水相體系的對象不同可以將其分為3種類型：離子液體/無機鹽體系、離子液體/表面活性劑體系與離子液體/糖體系，其中研究比較多的是離子液體/無機鹽體系，以磷酸鹽類的成相效果最好且應用最廣[12]。離子液體雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優點，具有分相時間短、黏度低、萃取過程不易乳化、萃取率高、分離條件溫和、離子體系易回收利用、綠色環保等優勢[12-14]。

近年來，離子液體雙水相萃取法在生物工業分析、藥物分析、金屬分離等領域的應用成為了研究的熱點[14]，在合成著色劑的萃取分離研究中，也逐漸被關注。鄧凡政等[15]建立了一種用離子液體雙水相體系對莧菜紅進行萃取的方法。Sha等[16]建立了一種用離子液體雙水相體系對不同食品樣品中5種合成著色劑進行萃取的方法。但目前國內外運用離子液體雙水相體系檢測食品中多種常用合成著色劑的方法報道仍然較少，因此，試驗建立了一種離子液體雙水相萃取-高效液相色譜法快速檢測飲料中8種合成著色劑（新紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅和赤蘚紅）的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；ST16型臺式離心機（德國Thermo公司）；XP 205型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HMV-50A型多管漩渦混合器（上海珂淮儀器有限公司）；Milli-Q純水機（德國默克公司）。

1.2 標準物質與試劑

新紅（農業部環境保護科研監測所）；日落黃、胭脂紅、亮藍、赤蘚紅（中國計量科學研究院）；誘惑紅（北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司）；酸性紅（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH）；靛藍（北京北方偉業計量技術研究院）。

甲醇（色譜級，德國默克公司）；乙酸銨（優級純，天津市大茂化學試劑廠）；硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸（分析純，上海山浦化工有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[C4MIM]Br）、1-癸基-3-甲基咪唑溴鹽（[C10MIM]Br）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C6MIM]BF4）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C8MIM]BF4）（純度均為99%，上海成捷化學有限公司）；試驗用水為GB/T 6682規定的一級水。0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液及200 g/L的檸檬酸水溶液，均用蒸餾水配制。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃。檢測波長：新紅，508 nm；靛藍，288 nm；胭脂紅、日落黃、誘惑紅，240 nm；亮藍，628 nm；酸性紅，518 nm；赤蘚紅，530 nm。進樣量10 μL；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4 標準儲備溶液配制

1.0 mg/mL酸性紅標準儲備溶液：稱取適量酸性紅標準品于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻即得。

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品溶液的制備

取空白飲料樣品（含二氧化碳樣品加熱或超聲10 min驅除二氧化碳），用200 g/L的檸檬酸水溶液調節pH至6.0，經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.5.2 離子液體雙水相萃取

在10 mL的離心管中加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br，和一定量的混合標準溶液或樣品溶液（1.0 mL），加水稀釋至5.0 mL，然后加入5.5 g K2HPO4，渦旋10 min使其充分溶解并形成渾濁的溶液，以8 000 r/min離心5 min，富集離子液體的上相體積約為120 μL。取10 μ L注入高效液相色譜分析測定。

1.6 定量分析

合成著色劑在雙水相中的萃取效果通過萃取率（E）描述[17]。按式（1）計算：

式中：Vt為萃取后上相體積，mL；Ct為所測溶液中合成著色劑的質量濃度，μg/mL；V為加入的標準溶液體積，mL；C為標準溶液質量濃度，μ g/mL。

2 結果與討論

2.1 離子液體的選擇

試驗考察了[C4MIM]Br、[C10MIM]Br、[C6MIM]BF4、[C8MIM]BF4共4種離子液體對8種合成著色劑的萃取效率（每組3個平行樣）。結果表明，通過短時間（約30 s）手動振搖，離子液體的相分離能力順序為：[C6MIM]BF4≈[C8MIM]BF4＜[C4MIM]Br≈[C10MIM]Br。考慮到[C4MIM]Br的成本和黏度均低于[C10MIM]Br，選擇[C4MIM]Br進行進一步研究。

2.2 鹽種類的選擇

作為雙水相體系的重要組成部分，無機鹽的性質對雙水相體系的相平衡具有重要的影響。Gutowski等[11]和Sha等[16]的研究均揭示了離子液體/無機鹽雙水相體系的分相過程實質上是無機鹽與離子液體爭奪水分子的過程，其分相能力與離子液體的水化能力和無機鹽的鹽析能力密切相關，離子液體的水化能力越大分相能力越差，而無機鹽的鹽析能力越大其分相能力越強。試驗選擇了(NH4)2SO4、NaH2PO4、K3PO4、K2HPO4共4種鹽進行試驗（每組3個平行樣）。其中，K3PO4、K2HPO4能與[C4MIM]Br形成雙水相體系，相分離能力的順序為K3PO4＜K2HPO4，此順序與它們常溫下的水溶性是一致的。故選擇K2HPO4進行進一步研究。

2.3 pH的選擇

溶液的pH是影響萃取效率的一個重要因素，溶液的酸堿性會影響萃取物在溶液中的存在形式，因此調節溶液的pH從而改變萃取物在溶液中的溶解度，使萃取物更易在萃取溶劑中存在，以達到萃取的目的[10,18]。 根 據 國 家 標 準[4]、 進 出 口 行 業 標 準[5]及 文獻[10, 15-16]報道，考察了pH 4.0～6.0對萃取率的影響（每組3個平行樣），結果表明，在pH 6.0時，萃取率最高。因此，在制備樣品溶液時，選擇調節pH至6.0后備用。

2.4 離子液體加入量的影響

離子液體的加入量是決定萃取率的關鍵因素，得到一種離子液體加入量少、萃取率高的雙水相體系十分重要。當[C4MIM]Br的加入量低于300 μL時，上相體積太小，移取困難，無法進行檢測，故考察了[C4MIM]Br的加入量在300～700 μL范圍內對萃取率的影響（每組3個平行樣），結果見圖1。[C4MIM]Br的加入量在300～500 μL范圍內隨其加入量的增加，8種合成著色劑的萃取率呈遞增趨勢，當[C4MIM]Br的加入量為500 μL時，8種合成著色劑的萃取率最高。綜合考慮萃取率、富集倍數和降低[C4MIM]Br的使用成本，選擇加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液進行后續試驗。

圖1 離子液體加入量對8種合成著色劑萃取率的影響

2.5 鹽加入量的影響

試驗考察了K2HPO4的加入量在5.0～6.5 g范圍內對萃取率的影響（每組3個平行樣），結果見圖2。在5.0～6.5 g范圍內，8種合成著色劑的萃取率均在K2HPO4的加入量為5.5 g時達到最大值。因此，為了達到更高的萃取效率，選擇K2HPO4的加入量5.5 g。

圖2 鹽加入量對8種合成著色劑萃取率的影響

2.6 萃取時間和離心時間的影響

通過添加一定量的鹽，很容易形成離子液體雙水相體系。試驗比較了手動振搖30 s（從添加鹽到離心之前的時間）、渦旋5 min、渦旋10 min、渦旋15 min共4種不同萃取時間對萃取率的影響（每組3個平行樣）。結果表明，渦旋10 min相較于其他萃取時間的萃取率更高。為使上下相達到快速的分離，研究了以8 000 r/min離心5～20 min對萃取率的影響。試驗發現，離心時間5 min以上，8種合成著色劑的萃取率基本不變，為了節省實驗時間，選擇離心時間5 min。

2.7 線性范圍及檢出限

分別量取適量標準儲備溶液，加水定容至刻度，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的混合標準溶液。再將1.0 mg/mL混合標準溶液作為母液，用pH 6的水（用200 g/L的檸檬酸水溶液調節pH至6.0）分別稀釋成質量濃度為30，60，300，600和1 200 μg/L的混合標準工作溶液，在所優化的試驗條件下富集、高效液相色譜檢測，以各個組分的峰面積和濃度繪制標準曲線，以3倍信噪比計算檢出限，結果見表2。

表2 各組分的線性方程、線性范圍、相關系數及檢出限

2.8 加標回收率和精密度試驗

表3 精密度與回收率試驗結果（n=6）

圖3 混標及空白樣品加標色譜圖

取空白飲料樣品，分別添加適量混合標準溶液，使3組樣品（每組6個平行樣）中各組分的加標量分別為50 μg/L（低），250 μg/L（中）和500 μg/L（高）三個水平，按“1.5”處理樣品進行回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），結果見表3。混標色譜圖和空白樣品加標色譜圖見圖3。結果表明，各組分的平均回收率為86.5%～99.0%，RSD為0.3%～3.8%。該方法回收率和重現性良好，結果準確可靠，可以采用外標法進行準確定量。

3 結論

試驗建立了一種離子液體雙水相萃取-高效液相色譜法快速檢測飲料中8種合成著色劑（新紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅和赤蘚紅）的方法，對萃取劑的種類及體積、鹽的種類及添加量、樣品pH、萃取時間、離心時間等因素進行了優化。同時考察了方法的線性范圍、方法檢出限、加標回收率及精密度等。試驗證明，該方法綠色環保、操作簡單、靈敏度高、回收率和重現性良好，可以為飲料中8種合成著色劑的大批量快速檢測提供依據。