氣質聯用法檢測養殖蝦中的5種雌激素殘留

王丹華，陳盼盼*，王宏亮

1. 臺州職業技術學院（臺州 318000）；2. 臨海市食品藥品檢驗檢測中心（臺州 317000）

民以食為天，食以安為先。隨著我國經濟社會的不斷發展，老百姓的餐桌不斷豐富的同時，食品安全問題日益成為老百姓關注的焦點。蝦，是老百姓非常喜愛的一類水產品，現階段隨著蝦養殖業的不斷發展，據調查少部分不法養殖戶在養殖蝦的過程中，使用雌二醇、己烯雌酚等雌激素，用以提高蝦的養殖速度和產量。雌二醇等雌激素是一類有廣泛生物活性的類固醇化合物，具有促進和維持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并對內分泌系統、肌體的代謝和骨骼的生成和成熟有影響[1-4]；近年來，不斷有調查發現大量水生生物出現性別畸形，如雌性貝類長出來了雄性器官、雄性虹鱒魚體內發現有卵黃蛋白等，因此加強對養殖蝦中的雌激素監測，具有重要的現實意義。

養殖水產品中雌激素的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜法[5-13]。液相色譜法及氣相色譜法專屬性偏差，易出現假陽性的結果；液相色譜-質譜法檢測雌二醇等低沸點的雌激素，靈敏度差；相比較而言，氣相色譜-質譜法更適用于雌二醇、己烯雌酚等低沸點的雌激素，且氣相色譜-質譜法檢測成本更低，適于該方法的推廣使用。加速溶劑萃取（ASE）的方法是一種在提高溫度和壓力的條件下，用有機溶劑萃取的自動化方法[14-15]。該方法有機溶劑用量少、快速、基質影響小等優點，已在食品、藥品、環境等領域得到廣泛應用。試驗建立一種利用加速溶劑萃取法提取養殖蝦中的雌二醇等雌激素，氣相色譜-質譜法進行定性定量分析的方法。結果表明，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、檢測結果準確等優點。

1 材料與方法

1.1 儀器部分

氣相色譜-質譜聯用儀（型號2010plus-TQ 8040，日本島津）；色譜柱Rtx-5 MS（日本島津）；氮氣吹干儀（MTN型，北京華瑞博遠）；電子天平（XS204型，0.1 mg，瑞士梅特勒）；純水器（Milli-Q，美國Milli Pore）；加速溶劑萃取儀（Dionex ASE 350型，美國Thermo Fisher）。

高速冷凍離心機（FRESCO17型，熱電（中國））；氮吹儀（N-EVAP-24型，美國Organomation公司）；恒溫干燥箱（FED115型，德國Binder）。

1.2 試劑部分

雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇標準物質（純度≥99%，德國Dr. Ehrenstorfor公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國merck試劑公司）；純化水（自制）；弗羅里硅土（分析純，上海國藥）；衍生化試劑：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）、三甲基硅烷，美國Sigma公司。

1.3 色譜參數

氣相色譜：進樣口溫度250 ℃；毛細管色譜柱：Rtx-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；氦氣流量：1.5 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。色譜柱溫度：50 ℃保持1 min；20 ℃/min升溫至160 ℃，15 ℃/min升溫至280 ℃，保持8 min。

質譜：離子源，電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時間：2 min；檢測方式：多反應監測模式（MRM）。

1.4 樣品溶液配制

樣品預處理：取養殖蝦的可食用部分，充分勻漿后置于樣品盒中冷凍保存，備用。

樣品提取：稱取5 g（精確至0.01 g）已預處理的樣品，加入5 g弗羅里硅土，與樣品充分混勻，用體積比1︰1的乙腈-乙酸乙酯混合溶劑作為提取溶劑，在加速溶劑萃取儀中萃取。萃取條件：提取溫度85 ℃，壓力10.0 MPa，靜態提取時間6 min，提取次數3次，淋洗體積60%，氮氣吹掃50 s。

向吹干的殘渣中加入100 μL衍生化試劑，蓋緊具塞試管并渦旋1 min，置于60 ℃烘箱中反應60 min，取出后冷卻至室溫，進樣氣相色譜-質譜測試。

1.5 溶液配制

衍生化試劑：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）-三甲基硅烷（99︰1，V/V）。1.5.1 標準儲備溶液

準確稱取雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇標準物質，各0.1 g（精確至0.001 g），分別置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1 mg/mL的各單標儲備液；將儲備液置于-18 ℃冰箱保存備用，保質期6個月。

1.5.2 標準曲線溶液

精密量取1 mg/mL雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇儲備溶液，各1 mL，置于100 mL量瓶中，得到100 μg/mL混標液。移取一定量體積的混標液，配制含各雌激素質量濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0 μg/mL的系列混合標準溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。

2 結果與討論

2.1 萃取條件的優化

萃取溫度對萃取結果至關重要。試驗考察了70，80，90，100和110 ℃ 5個不同溫度對雌激素殘留效果的影響。結果發現，當溫度由70 ℃升至90 ℃時，各雌激素提取結果增加顯著；當繼續升溫至110 ℃時，萃取結果基本恒定，因此選擇90 ℃作為最佳提取溫度。

2.2 洗脫溶劑選擇

洗脫溶劑的選擇至關重要，它直接影響樣品的凈化效果和分析物結果的準確度。洗脫溶劑必須要對此次試驗的5種雌激素具有較好的洗脫能力。水產品中雌激素的分析常用的洗脫溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯。試驗發現，當甲醇作為洗脫溶劑時，雌激素的靈敏度較低；當乙腈作為洗脫溶劑時，萃取效果好，回收率高，但是去除蝦中的脂肪效果差，干擾物較多；乙酸乙酯洗脫，能有效地去除脂肪，且5種雌激素的回收率較高。乙腈和乙酸乙酯合用既有效去除脂肪，又能到較高的回收率。因此，選擇體積比1︰1的乙腈-乙酸乙酯作為萃取雌激素的萃取溶劑。

2.3 質譜條件的選擇

首先對5種雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）標準樣液以Q3SCAN模式全掃描，以確定5種雌激素的保留時間，并找出各自的產物離子；在MRM模式下對產物離子進行碎片離子掃描，得到對應的碎片離子。選擇響應值高的1個離子作為定量離子，另選3對離子作定性離子。選擇好定量及定性離子后，對MRM方法進行轟擊電壓、離子比率等質譜條件的優化，確保目標峰靈敏度達到最佳。1對定量離子對、3對定性離子對結合保留時間，排除了假陽性樣品的存在，確保5種雌激素檢測結果準確。5種雌激素離子對及質譜相關參數選擇如表1所示。

表1 5種雌激素殘留離子相關信息

圖1 5種雌激素標準譜圖

2.4 標準曲線及檢出限

吸取一定量1.5.2項下配制的標準曲線溶液至2 mL去活的樣品反應瓶中，氮氣吹至近干，加入100 μL衍生化試劑，按照1.4衍生化方法衍生操作。按1.3色譜質譜條件上機進樣。以各雌激素質量濃度為橫坐標，對應的響應值為縱坐標，繪制標準曲線。以信號噪聲的比值（S/N=3）計算各激素的檢出限。標準曲線及檢出限結果見表2。

由表2可以看出，5種獸藥激素在0.01～1.0 μg/mL線性范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.995，且靈敏度高，農藥檢出限均在0.09～0.14 μ g/kg范圍內。

表2 5種環境雌激素標準曲線、相關系數及檢出限

2.5 加標回收試驗與精密度測試

取不含待檢5種雌激素的養殖蝦空白樣品，在標準曲線濃度范圍內加入低（1 μg/kg）、中（5 μg/kg）、高加標量（10 μg/kg）三個不同濃度水平的雌激素混合標樣，按照1.4方法處理樣品，考察加標回收結果。每個濃度水平的加標樣品平行進樣6次，考察精密度6次測定結果的相對標準偏差。回收率與精密度檢測結果詳見表3。可以看出，5種雌激素3個濃度點的加標回收率在80.6%～93.9%之間，進樣6次方法精密度RSD在1.67%～4.72%之間。

表3 6種環境雌激素加標回收率

2.6 實際樣品的測定

抽取30份市場售賣的養殖蝦（對蝦、小白蝦等），運用試驗所建立的方法對5種雌激素殘留進行檢測。結果未發現5種雌激素的檢出；說明本地養殖蝦基地無雌激素添加的情況出現。

3 結論

試驗建立了一種加速溶劑萃取-氣相色譜質譜法檢測養殖蝦中5種雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）殘留的方法。該方法采取加速溶劑萃取儀對養殖蝦樣品進行提取、凈化，選擇乙腈-乙酸乙酯（體積比1︰1）作為提取溶劑，采用衍生化方法進樣氣相色譜質譜對5種雌激素進行檢測。試驗對萃取條件進行了優化、對洗脫溶劑的選擇使用進行了分析討論；對質譜條件進行了優化；考察了方法的線性曲線及檢出限、準確性（加標回收）與精密度等，并對實際樣品進行了測試。結果表明，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、檢測結果準確的優點，可用于養殖蝦中該5種雌激素的監測。