高效液相色譜法測定竹筷中15種防菌防腐劑

周銘林，何海彤，李聰*

廣東產品質量監督檢驗研究院（佛山 528300）

竹筷是以竹材、木材為原材料，經過適當的材質預處理，進行加工后用于食品接觸的竹木類食品相關產品[1]。近年來，隨著外賣、快餐等餐飲行業迅速發展，竹筷成為必不可少的用餐工具，相應衛生監控問題不斷浮現[2-4]，而霉變腐爛問題尤為突出[5-7]，一些生產企業采用價格低廉的化學防腐處理，如大量采用含硫漂煮劑、噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯苯、抑霉唑等化學防菌防腐劑，導致該類添加劑在產品中殘留超標風險增加，從而增加食品用竹木產品的安全隱患[8-9]。因此，建立高效、簡便的檢測方法實現竹筷中多種防菌防腐劑同時檢測，對該行業的食品安全控制具有重要意義[10]。

中國多數竹木筷產品檢測參照GB 19790.1—2005《一次性筷子第1部分：木筷》和GB 19790.2—2005《一次性筷子第2部分：竹筷》[11-12]，該標準規定中只對噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯苯、抑霉唑有相應檢測方法，而常使用的防菌防腐劑，如苯甲酸、尼泊金酯類、納他霉素等，尚未建立多種防菌防腐劑同時快速檢測方法[13-17]，因此竹木食品相關產品不能得到有效監控。試驗運用二極管檢測器在230 nm及254 nm波長下檢測，外標法定量，建立高效液相色譜法同時分離檢測苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、多菌靈、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、納他霉素、噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、五氯酚、抑霉唑、聯苯15種常用于食品及日化產品防菌防腐劑。解決檢測手段僅能檢測常規的幾種防菌防腐劑而無法對相關竹木食品相關產品進行有效監控的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（分析純，天津致遠化學試劑有限公司）；甲醇、甲酸、乙酸銨（色譜純，德國CNW Technologies GmbH公司）；苯甲酸、山梨酸、五氯酚（中國計量科學院）；苯甲醇、多菌靈、抑霉唑、聯苯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、鄰苯基苯酚、噻苯咪唑（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；富馬酸二甲酯、納他霉素（TM standard）。

1.2 儀器與設備

LC-30超高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測器，日本島津公司）；JP-0600超聲波清洗機（廣州吉普超聲波電子設備有限公司）；高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；JJ 500 Y電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；Milli-Q超純水純化系統（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配置

準確稱取或移取一定量固體標準品及標準儲備液至容量瓶中，用甲醇定容配制成混合中間液，使用時根據濃度逐級稀釋成系列濃度標準溶液。

1.3.2 樣品溶液的配置

將固體樣品切割并剪磨為粒徑小于5 mm×5 mm顆粒，準確稱取1 g（準確至0.001 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，擰緊蓋子，渦旋混勻后超聲提取20 min，在旋渦混勻器上混勻3 min，以3 000 r/min離心3 min，上清液轉移至雞心瓶中用旋轉蒸發器蒸發至近干，用甲醇定容至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱，Agilent（ZORBAX SB-C18）；柱溫30℃；進樣量20 μL；流動相，A為0.02 mol/L 乙酸銨溶液（含0.03%乙酸），B為甲醇；流速0.8 mL/min；梯度洗脫；流動相梯度見表1。

表1 流動相梯度變化

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm對15種防菌防腐劑的標準溶液進行掃描，所有組分均在測試范圍內具有吸收峰，其中苯甲酸、富馬酸二甲酯在230 nm附近，山梨酸、苯甲醇、尼泊金甲、乙、丙、丁酯、鄰苯基苯酚、聯苯在250 nm附近有較強吸收，多菌靈、噻苯咪唑、納他霉素、抑霉唑、聯苯在270～300 nm處。由于苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、富馬酸二甲酯、多菌靈的極性較強，出峰時間短，且多菌靈在230 nm下響應較254 nm處更強，抑霉唑與聯苯出峰時間最長，考慮抑霉唑在250 nm附近吸收弱，且出峰時間比聯苯早，確定7種組分的檢測波長為230 nm，尼泊金甲、乙、丙、丁酯、鄰苯基苯酚、噻苯咪唑、納他霉素、五氯酚的檢測波長為254 nm，采用雙波長分段檢測即可兼顧各組分靈敏度。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 流動相體系的確定

對比食品及化妝品中防腐劑檢測常用流動相：甲醇-水、甲醇-乙酸銨、甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）下各組分的分離效果及出峰時間。結果表明，流動相為甲醇-水時，苯甲酸、山梨酸、尼泊金丙酯峰型不對稱，抑霉唑與聯苯色譜峰出現部分重疊，影響分離效果；添加乙酸銨后，組分峰型得以改善，但苯甲酸、山梨酸出峰時間提前，苯甲酸與基底雜質峰重疊；流動相為甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）時，苯甲酸色譜峰可與基底雜質峰分離，且尼泊金丙酯色譜峰可與納他霉素色譜峰分離。因此，選用甲醇-乙酸銨（含0.03%乙酸）作為流動相。

流動相體系確認后，對甲醇初始比例進行優化（5%，20%，30%和40%），甲醇比例5%時，試驗需58 min，逐步提高初始甲醇濃度至40%，試驗時長可縮短至44 min，且各組分分離可保持良好。因此，以40%作為初始甲醇濃度。

2.2.2 色譜柱的選擇

高效液相色譜法檢測防菌防腐劑主要采用C18柱，試驗比較Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）及耐酸色譜柱Agilent Zorbax SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），150 mm色譜柱未能將所有組分完全分離，而組分在Extend-C18色譜柱及耐酸色譜柱中保留時間沒有顯著性差異，耐酸色譜柱較長柱優勢在于在同等試驗條件下苯甲醇色譜峰吸收更強，且流動相為酸性條件，酸柱在低pH條件下，具備良好穩定性。

2.2.3 流速的選擇

分析不同流速（0.7，0.8和0.9 mL/min）對各組分分離效果的影響，試驗表明，流速增快，各組分保留時間提前，但整體分離效果變化不大，考慮0.9 mL/min流速柱壓較0.8 mL/min高，試驗選用流速0.8 mL/min，在最優試驗條件下獲得的標準樣品圖見圖1，尼泊金丁酯陽性樣品圖見圖2。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

在最佳色譜條件下，對混合標準溶液進行測定，以峰面積為縱坐標Y，質量濃度為橫坐標X，繪制線性回歸方程，得到各化合物的線性回歸方程。以3倍信噪比計算方法檢出限，結果見表2。

2.4 方法的準確度與精密度

選取空白試樣，采用試驗前處理方法處理后，添加3個不同水平的標準溶液，每個添加水平重復測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD%），結果見表3。

圖1 15種標準品圖譜

圖2 尼泊金丁酯檢出樣品

表2 線性范圍、回歸方程與檢出限

表3 樣品的加標回收率及精密度（n=6）

2.5 實際樣品分析

采用該方法隨機選取市售的30批次竹木筷子進行檢測，結果在30批次產品中，4個批次產品檢出尼泊金丙酯，濃度在3.2～5.4 mg/kg之間，2個批次產品檢出尼泊金乙酯，1個批次檢出濃度為5.2 mg/kg，抑霉唑，未發現超限量使用情況。

3 結論

建立一種同時測定竹筷中15種防菌防腐劑的高效液相色譜檢測方法，對色譜分離條件進行優化，以0.02 mol/L乙酸銨（含0.03%乙酸）和甲醇溶液為流動相進行梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器進行檢測，達到良好分離效果。該方法操作簡單，準確度精密度均可滿足日常監測需求。