分光光度法和液相-質譜聯用法檢測奶粉中的左旋肉堿

王冬梅，楊明，邱肖依，胡筱靜，朱有濤，康翠欣

武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430000）

左旋肉堿（L-carnitine），又稱左卡尼汀、肉毒素或維生素BT，是一種促使脂肪轉化為能量的類氨基酸，對人體無不良反應[1]。肉堿屬于類維生素，是人體自身合成的營養，是一種天然的物質。左旋肉堿主要添加于嬰兒奶粉、老年人食品及運動員、高強度作業者食品和飲料中[2-3]。左旋肉堿作為營養強化劑用于嬰兒食品，在維持嬰兒生命及促進嬰幼兒發育的某些生理過程中發揮著重要的作用，如生酮作用、氮代謝[4]，所以左旋肉堿對嬰幼兒來說是一種重要的營養物質。GB 10765—2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》規定，左旋肉堿為可選擇性加入成分，規定最小添加量為0.3 mg/100 kJ[5]。

試驗以嬰兒奶粉為研究基質，分別采用高效液相色譜質譜聯用法和分光光度法進行檢驗，對兩種方法的回收率、精密度檢驗結果進行比較，同時說明兩種方法的檢測結果是否存在顯著的差異。

1 材料、試劑和儀器

1.1 儀器與設備

SCIEX 4500 QTRAP串聯質譜儀（配有可用于電噴霧電離的Turbo V離子源），美國AB SCIEX公司；LC 30A液相色譜儀（日本島津公司）；電子分析天平（ME204/02），METTLERTOLEDO，Switzerland；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津有限責任公司；實驗室pH計，FE20，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

1.2 試劑

鹽酸（分析純）、甲酸（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），試驗用水為二次蒸餾水；高氯酸（HClO4）、氫氧化鈉（NaOH）、氫氧化鉀（KOH）、2-硝基苯甲酸（C14H8N2O8S2）、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（C8H18N2O4S）、乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2·2H2O）、乙酰輔酶A（Acetyl CoA），在2～8 ℃保存；乙酰肉堿轉移酶（CAT）：在2～8 ℃保存。

2 樣品測定方法

2.1 紫外分光光度法分析步驟[6-7]

2.1.1 標準溶液配制

左旋肉堿標準儲備液（80 μg/mL）：準確稱取20 mg（精確0.000 1 g）于102±2 ℃烘箱中烘2 h的左旋肉堿，用水定容至250 mL容量瓶中。此液置于4 ℃冰箱中可保存1個月。

左旋肉堿標準工作液：分別吸取0.5，1，2，3和5 mL左旋肉堿標準儲備液于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。此溶液僅限于當天使用。

2.1.2 試樣處理

1) 準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）混合均勻的固體樣品于燒杯中，用30 mL 40 ℃溫水溶解，轉入100 mL容量瓶中。加入10 mL 13% HClO4溶液，混合均勻后靜止20 min，用蒸餾水定容至刻度，混勻，用定量濾紙過濾。

2) 取20 mL濾液，用4 mol/L KOH溶液調pH至12.5～13.0后，于40 ℃水浴60 min。冷卻后用13% HClO4調pH至7.0～7.5。將樣液轉入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。混勻后置于4 ℃冰箱中過夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫，取上清液，用0.45 μm濾膜過濾后備用。

2.1.3 標準曲線的繪制

吸取2.0 mL左旋肉堿標準工作液于1 cm比色皿中，加入0.8 mL顯色工作液和100 μL乙酰輔酶A溶液，蓋上比色皿蓋，混合均勻后放入分光光度計中，分光光度計的波長調為412 nm，5 min后歸零。迅速加入100 μL乙酰肉堿轉移酶溶液，混合均勻后放入分光光度計中，反應10 min后記錄吸光度。以左旋肉堿標準工作液的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，制作標準曲線。

2.2 高效液相色譜質譜聯用[7-8]

2.2.1 儀器分析條件

色譜柱XBridgeTMBEH HILIC（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）Column XP；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。流速：0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。進樣量：2 μ L。洗脫梯度程序見表1。

表1 洗脫梯度程序

2.2.2 質譜條件

采用電噴霧離子化源（AJS ESI源），正離子多反應監測模式（MRM）檢測。離子噴射電壓5 000 V，溫度500 ℃，源內氣體1（gs1，N2）壓力50 psi，源內氣體2（gs2，N2）壓力50 psi，氣簾氣體（N2）壓力35 psi。采用切換法，左旋肉堿在4.22 min左右出峰，將2～6 rain的流出液導入離子源進行分析。左旋肉堿的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數如表2所示。

表2 左旋肉堿的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數

2.2.3 標準溶液配制

精密稱取左旋肉堿，用水溶解，配制成80 μg/mL的儲備液，再用蒸餾水稀釋，配制成1 μg/mL的中間液。中間液用蒸餾水稀釋成系列對照溶液供分析用。

2.2.4 樣品的前處理

稱取8 g均勻樣品于50 mL離心管中，加入40 mL水，渦旋混勻1 min，取2.5 mL上述混勻樣品，轉移至50 mL離心管中，加入1.5 mL水，再加入16 mL乙腈-水（3︰1，V/V），提取液渦旋混勻1 min，再加入5 mL氫氧化鉀水溶液（1 mol/L）渦旋混勻1 min，于60℃水浴振蕩提取30 min，靜置在冷水浴中，冷卻至室溫，加入5 mL鹽酸水溶液（1 mol/L）渦旋混勻1 min，取1.8 mL混合液至離心管，以14 000 r/min離心5 min，取上清液，過微孔濾膜，用水稀釋100倍，供高效液相色譜-質譜聯用儀分析。

3 結果對比

3.1 紫外分光光度計法標準曲線

用紫外分光光度計法制定的標準曲線如圖1所示。在0～16 μg/mL范圍內，用分光光度計測得的標準曲線線性關系很好。

圖1 紫外分光光度計標準曲線

3.2 液質聯用標準曲線、檢出限

以0，2，10，50和200 ng/mL質量濃度左旋肉堿標液為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性方程Y=7.92×104X+2.76×104，R2=0.998，說明在0～200 ng/mL范圍內，呈現良好線性關系。結果見表3。

液質聯用檢出限：取儲備液逐級稀釋，進樣量為2 μ L。以信噪比S/N=3計算左旋肉堿的檢出限（LOD），以信噪比S/N=10計算其定量下限（LOQ），并以標準品的質量進行計算，得到左旋肉堿的LOD為0.109 μg/kg，LOQ為0.364 μg/kg，能夠滿足實際樣品分析對檢測限的要求。

3.3 兩種方法結果對比

3.3.1 兩種方法回收率結果

以市場購買的嬰幼兒乳粉作為基礎樣品，分別添加5，10，15和20 mg/100 g標準物質，采用分光光度法和液質聯用法進行測定，每個樣品檢測2次，對其回收率和精密度進行比較，兩種方法的加標回收率及相對標準偏差見表4。分光光度法的回收率為96.20%～101.40%，相對標準偏差為0.24%～1.95%。液質聯用法的回收率為97.70%～103.80%，相對標準偏差為1.51%～2.94%。兩種方法的回收率均良好。

表3 液質聯用標準曲線

表4 兩種方法的加標回收率及相對標準偏差比較

3.3.2T檢驗和F檢驗結果

分別用分光光度法以及液質聯用法多次測定同一種樣品中的左旋肉堿的含量，結果見表5。

表5 分光光度法與液質聯用法測定左旋肉堿的數據對比

分別用F檢驗和T檢驗分析分光光度法與液質聯用法的檢測結果，其中F-檢驗雙樣本方差分析的結果見表6，T檢驗雙樣本等方差假設的結果見表7。

從F檢驗的結果來看，p＞0.05，說明兩種方法數據的方差無顯著差異，檢驗平均值時應采用等方差t檢驗。

表6 F-檢驗雙樣本方差分析

從T檢驗的結果來看，p＞0.05，說明兩種方法數據的平均值無顯著差異。從平均值結果也可以看出，液質聯用法的平均值比分光光度法的平均值大0.10 mg/100 g，這可能是分光光度法的核心為酶反應和顯色反應，因此效率并非100%，所以分光光度法的結果略低于液質聯用法。但兩種方法的檢測結果并無顯著差異。

表7 T-檢驗：雙樣本等方差假設

4 結論

通過分光光度法和液質聯用法進行左旋肉堿的加標回收率的和精密度的比較，結果發現兩種方法的回收率均良好，均適用于嬰幼兒乳粉的檢測。另外對兩種方法的檢驗結果進行數據分析，通過F檢驗，發現兩種方法的方差無顯著差異；通過T檢驗發現，兩種方法的平均值也無顯著差異。兩種方法均可作為嬰幼兒乳粉中左旋肉堿含量的檢測方法，實際應用過程中，可根據樣品量，設備價格等多方面考慮選擇。