氣相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量

張雪，張麗茹，王為，蔡冬冬，張筠*

1. 黑龍江東方學院食品與環境工程學部（哈爾濱 150066）；2. 呼倫貝爾雙娃乳業有限公司（呼倫貝爾 162750）

由于個人、社會等多方面外界因素的影響，許多地區出現了母乳喂養量缺乏、營養缺乏以及母乳喂養條件缺乏等情況，因此對母乳替代品——嬰兒配方奶粉的研究備受重視[1]。嬰兒配方奶粉中脂肪酸組成較牛乳更接近于人乳，但不能完全替代人乳，那么生產脂肪母乳化嬰兒配方奶粉已成為乳品行業急待解決的重要問題[2]。1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡稱OPO）現已經證實具有促進鈣吸收和利用、促進嬰兒發育、減少便秘和產梗阻發生的功能[3-6]，所以近年來被廣泛應用于保健食品、嬰幼兒配方乳粉等領域。

中國人民共和國衛生部于2008年發布的第13號公告中，批準1, 3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（簡稱OPO）作為營養強化劑使用在嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中[7]，并于2010年第1號公告中擴大其使用范圍及使用量[8]。

目前，國內還沒有建立關于檢測嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的標準。國內外對于OPO的檢測方法主要有氣相色譜法[9-12]、液相色譜法[13-18]、氣相色譜-質譜聯用法[19-20]等，其中高效液相色譜法[21]是目前較廣泛的方法，但使用的銀離子色譜柱的穩定性差，柱子的使用率太低且壽命短，測定時間較其他方法長，回收率欠佳，并不適用于OPO的分離測定。結合實際情況，氣相色譜法使用并不普遍，現有文獻中的方法也并沒有對方法進行深入研究，但氣相色譜法較為穩定，測定的結果普遍準確且含量較高，因此試驗擬建立一種測定乳粉中OPO含量的方法，旨在得到一種重現性好、精密度高且回收率高、結果準確的方法，使其越來越多地被應用到嬰幼兒配方乳粉中OPO的定量檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25%氨水（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；無水乙醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；無水乙醚（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；石油醚（優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；正己烷（德國Merck公司）；OPO標準物質（美國Sigma公司）；十七烷酸甘油三酯標準物質（美國NU-CHEK公司）；剛果紅指示劑（濃度10 g/L）；氮氣；氫氣（純度≥99.995%）；氧氣；0.22 μm尼龍濾膜（有機相）：上海安普生物科技有限公司；DB-1HT色譜柱（30 m×0.25 mm×0.1 μm，Agilent Technologies公司）。

1.2 儀器與設備

7890（FID）型氣相色譜儀：Agilent Technologies公司；BT 125 D型電子天平（德國Sartorius公司）；TST-UPB-20型超純水機（泰斯特儀器有限公司）；KQ 3200 DE型數控沖超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DKS-2型電熱恒溫水浴鍋（泰斯特儀器有限公司）；XW-80 A型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；RE-52 AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SPB-3全自動空氣源（北京中惠普分析技術研究所）；SPH-300 A氫氣發生器（北京中惠普分析技術研究所）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

OPO溶液（1 mg/mL）：準確稱取25 mg OPO標準物質，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲存。

十七烷酸甘油三酯內標溶液（2.5 mg/mL）：準確稱取62.5 mg十七烷酸甘油三酯標準物質，用正己烷定容至25 mL并使其充分溶解，在4 ℃條件下儲存。

混合標準工作液：準確移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份準確加入100 μL十七烷酸甘油三酯內標溶液，用正己烷定容至1 mL。其中OPO質量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL，十七烷酸甘油三酯內標溶液質量濃度為250 μg/mL。

1.3.2 前處理條件優化

1.3.2.1 樣品前處理步驟

試驗選用已知OPO含量的奶粉進行測定，奶粉中的OPO含量是已知且穩定的，理論值為4.50±0.05 g/100 g。準確稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）樣品，加入10 mL 65 ℃的超純水，使其溶解，置于毛氏抽脂瓶中；加入35%的氨水，在一定溫度下水解15 min；加入10 mL 95%無水乙醇以及2滴剛果紅指示劑，再加入一定量的乙醚與石油醚；將合并后的有機相用無水硫酸鈉脫水，在65 ℃下旋轉蒸發至完全蒸干；將剩余的油脂用正己烷定容至25 mL，取2 mL上述液和1 mL內標溶液，用正己烷定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，即為待測液。

1.3.2.2 堿水解液用量的選擇

氨水溶液體系的加入可以破壞乳的膠體性以及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨水溶液體系中，而脂肪游離出來，參考GB 5009.6—2016第三法[22]，選用1，2和3 mL的體積來判斷氨水加入量對最終結果的影響。1.3.2.3 水解溫度的選擇

水解溫度會直接影響堿水解液溶解脂肪的速度，但水解時間相差太短并不能對結果產生顯著的影響，因此對水解溫度進行優化，試驗選擇室溫23 ℃與水浴65 ℃來判斷水解溫度對最終結果的影響。

1.3.2.4 萃取劑用量的選擇

乙醚與石油醚作為萃取脂肪的萃取劑，其用量直接影響到脂肪的提取率。因此對萃取劑用量進行優化，選用以下兩種方式來判斷萃取劑用量對最終結果的影響：

1) 加入25 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉入雞心瓶中，再加入5 mL 95%無水乙醇，加入15 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉入雞心瓶中，最后加入15 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉入雞心瓶中。

2) 加入25 mL無水乙醚振搖1 min，靜置分層后加入25 mL石油醚振搖1 min，靜置分層后，將上層有機相轉入雞心瓶中，再重復以上步驟提取2次。

1.3.2.5 萃取劑比例的選擇

試驗采用無水乙醚與石油醚作為萃取劑，萃取劑的比例同樣影響萃取脂肪的結果，因此試驗選用無水乙醚-石油醚比例分別為1︰1，1︰2和2︰1作為選擇條件。

1.3.3 色譜條件優化

參照馬小寧等[12]程序升溫方法進行改進。分別采用兩種程序升溫方式進行色譜條件優化，進樣樣品為0.1 g/100 g添加內標的OPO標準品。升溫程序（a）：初始溫度70 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至170 ℃，再以20 ℃/min的速率升至350 ℃，保持25 min；升溫程序（b）：初始溫度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min的速率升至300 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升至370 ℃，保持10 min。

進樣口溫度320 ℃；檢測器溫度370 ℃；載氣為氮氣，恒壓模式；進樣量1.0 μL；燃氣流量30.00 mL/min。

1.3.4 OPO含量計算

式中：X表示試樣中OPO的含量，g/100 g；C表示試樣中OPO的濃度，mg/mL；V表示試樣的定容體積，mL；m表示試樣的質量，mg；f表示稀釋倍數。

以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留兩位有效數字。

1.3.5 方法驗證

1.3.5.1 精密度

對同一添加OPO的乳粉樣品，在相同的測定條件下進行6次重復試驗，計算OPO含量以及相對標準偏差（RSD）。

1.3.5.2 加標回收率

稱取一定量的樣品，在3個加標水平下測定OPO含量，每個水平重復測定6次，計算回收率。3個水平的添加量分別為2.4，3.4和4.4 g。

1.3.5.3 標準曲線及相關性

移取100，200，300，400和500 μL OPO溶液，每份加入100 μL十七烷酸甘油三酯溶液，用正己烷定容至1 mL。配制成OPO質量濃度為100，200，300，400和500 μg/mL的系列溶液，對此混合標準溶液進行測定分析，以OPO含量為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線。

1.3.5.4 檢出限與定量限

稱取一定量的樣品，在相同的測定條件下進行3次重復試驗，以相當于3倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低檢出限；以相當于10倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低定量限。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 氨水體積的選擇

當加入1 mL氨水時，最終測得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.36±0.02 g/100 g，最后選用1 mL氨水作為前處理最優條件之一，樣品色譜分析圖如圖1所示。

2.1.2 水解溫度的選擇

在加入1 mL氨水的條件下，采用不同水解溫度進行試驗。由計算可知，當在65 ℃溫度下水解時，最終測得的OPO含量最高且最接近理論值，為4.45±0.03 g/100 g，最后選用在65 ℃溫度下水解作為前處理最優條件之一，樣品色譜分析圖如圖2所示。

圖1 加入1 mL氨水樣品色譜圖

圖2 65 ℃水解樣品色譜圖

2.1.3 萃取劑用量的選擇

在加入1 mL氨水、65 ℃溫度水解的條件下，采用不同萃取劑用量進行試驗。由計算可知，當采用萃取劑用量（a）時，最終測得的OPO含量是最高的，為4.46±0.03 g/100 g，同時在試驗過程中發現，采用萃取劑用量（b）時，萃取過程中會產生大量白色渾濁物體，沉淀不完全，導致肉眼無法觀察萃取情況，影響后續試驗操作與上機分析。綜上所述，最后選用萃取劑用量（a）作為前處理最優條件之一，樣品色譜分析圖如圖3所示。

圖3 萃取劑用量（a）樣品色譜圖

2.1.4 萃取劑比例的選擇

試驗以不添加OPO原料的嬰幼兒配方乳粉作為基質粉，準確稱取1 g基質粉，向其中加入3 g OPO標準品，以無水乙醚與石油醚的比例分別為1︰1，1︰2和2︰1為變量條件測定OPO含量，每個變量重復測定6次，測得結果如表1所示。

表1 以萃取劑比例為變量試驗結果 g/100 g

基質粉中OPO含量如圖4所示。已知基質粉中OPO含量約為1.72 g/100 g，加入標準品后的奶粉OPO理論含量約為4.72 g/100 g。表1表明，當無水乙醚︰石油醚比例為1︰1時，測定結果最接近于最終理論值。綜合比較，選擇無水乙醚與石油醚的比例1︰1作為前處理最優條件之一。

圖4 基質粉OPO色譜圖

綜上所述，前處理條件的最終選擇為：氨水體積1 mL、水解溫度65 ℃、萃取劑用量（a）、無水乙醚與石油醚的比例1︰1。

2.2 色譜條件優化

程序升溫（a）色譜圖如圖5所示。采用（a）程序升溫，內標物峰與目標峰的出峰時間均在13 min左右，內標物峰與目標峰分離效果不理想且峰型不好，雜峰較多，無法準確定位內標物峰與目標峰，為定量分析帶來困難。程序升溫（b）色譜圖如圖6所示。采用（b）程序升溫，內標物峰與目標峰的出峰時間均在12 min左右，內標物峰與目標峰分離效果理想且峰型良好，幾乎無雜峰，可以準確定位內標物峰與目標峰，適用于測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO含量。

2.3 精密度測定

對同一添加OPO的乳粉樣品進行6次重復試驗，計算OPO含量并進行精密度分析，計算其相對標準偏差（RSD），結果見表2。RSD值為2.57%，小于5%，表明儀器及方法的精密度與重現性良好，測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準確度。

2.4 加標回收率測定

準確稱取0.1 g樣品，依次添加3個不同水平的OPO標準品，每個水平重復測定6次，按上述試驗條件操作，計算回收率，結果如表3所示。結果表明，加標回收率平均為92.97%±5%，可以滿足分析方法對于加標回收率的要求，可以證明采用該方法測定嬰幼兒配方乳粉中的OPO具有較高的準確度，效果良好。

圖5 采用程序升溫（a）色譜圖

圖6 采用程序升溫（b）色譜圖

表2 精密度測定結果

表3 回收率測定結果

2.5 標準曲線及相關性

對不同濃度的OPO混合標準溶液進樣，進行線性回歸，結果如圖7所示。可以看出標準曲線濃度在0.1～0.5 g/100 g范圍內，含量與峰面積線性關系最好，證明該方法響應值與校正曲線一致度高，線性回歸方程為y=583.34x-13.858，相關系數R2=0.999 8。

圖7 OPO標準曲線

2.6 檢出限與定量限測定

以相當于3倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低檢出限為0.04 g/100 g；以相當于10倍信噪比待測液的量計算，得出OPO的最低定量限為0.14 g/100 g。

3 結論

試驗采用氣相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中OPO的含量，通過乙醚與石油醚提取乳粉中的脂肪，經過無水硫酸鈉脫水、旋轉蒸發濃縮等處理，結果表明其RSD為2.57%，回收率為92.97%±5%；在0.1～0.5 g/100 g范圍內，R2為0.999 8，檢出限為0.04 g/100 g，定量限為0.14 g/100 g。該方法操作簡便、精密度高、回收率良好、結果準確，適用于嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的檢測。