Smile來源的角膜基質透鏡構建組織工程角膜基質支架的實驗研究

葉 青，Ackbarkhan Zacharia，紀佳月，曾 靜

0引言

角膜病是世界第四大致盲性疾病[1]，角膜移植是角膜病重要的復明及治療手段。角膜存在的“免疫赦免”機制，使得角膜移植術成為成功率最高的器官移植手術，但角膜病變時常伴有強烈且持續的炎癥反應，因此角膜移植術后仍可出現免疫排斥反應。近年來，關于角膜移植的熱點問題主要集中在兩個方面：(1)如何擴增角膜供體來源；(2)如何減輕或避免移植后排斥反應。角膜供體的缺乏使得研究者致力于開發角膜替代物。組織工程角膜利用生物學、材料學、臨床醫學等知識, 構建具有良好生物相容性的種子細胞-生物材料支架的復合體。在多種生物支架材料中，豬角膜基質由于僅表達少量異種糖原抗體，且膠原的物種差異較小，因此成為目前研究最多的支架材料之一[2]。但豬角膜基質存在宗教或倫理道德的限制，以及感染異種疾病的風險，臨床實際應用受限。隨著全飛秒激光小切口微透鏡摘除術(small incision lenticule extraction，Smile)的興起，術中取出的光滑平整的人角膜基質透鏡，為組織工程角膜提供了更優的同種角膜基質組織材料來源。本研究利用人纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，FS)粘貼Smile術中取出的角膜基質透鏡，構建雙層角膜基質透鏡支架，探究不同保存方式對支架硬度、穩定性、透明度的影響；此外，從細胞生長、增殖等方面評估FS對人角膜基質細胞(human corneal fibroblasts，HCFs)的毒性作用，以期為臨床提供一種安全無毒、簡單易得的組織工程角膜支架材料。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器纖維蛋白粘合劑(RAAS)，Ι型膠原酶(Sigma)，胎牛血清、RPMI-1640培養基(Gibco)，MTT試劑盒(Multi Sciences)，無水甘油(Solarbio)，透明質酸鈉(Santen)；酶標分析儀(Thermo)，熒光顯微鏡(Nikon)，眼科手術顯微鏡(Zeiss)。

1.1.2組織來源人角膜基質透鏡取自2019-01/03于廣西醫科大學第一附屬醫院眼科行Smile術的近視患者97例194眼，其中男46例，女51例，年齡19～36歲，均排除其他眼部及全身疾病。角膜基質透鏡取出后立即置于無菌RPMI-1640培養基，于2h內轉移至超凈臺。編號并記錄患者的姓名、性別、年齡、術前屈光度、角膜基質透鏡的直徑及中央厚度。本次研究已通過廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審查。

1.2方法

1.2.1 HCFs體外分離和培養由于Smile手術是直接在角膜基質層做預設深度的切削，取出的組織僅有角膜基質組織，而角膜基質組織主要是由大量的膠原纖維和成纖維細胞構成的，因此用Ι型膠原酶消化取出的角膜基質組織，將得到的細胞懸液進行體外培養后，得到的細胞即是基質層來源的角膜成纖維細胞。將術中取出的角膜基質透鏡置于PBS緩沖液中洗滌2～3次，用1.5g/L Ⅰ型膠原酶溶液于37℃消化至組織塊溶解，1000r/min離心5min，棄上清，將細胞稀釋后接種于培養瓶，2～3d換液1次，約7d后按1∶3接種傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞生存率將纖維蛋白粘合劑置于15mL完全培養基(含10%胎牛血清)中，于37℃恒溫箱中72h，收集浸提液。以3 000個/孔的密度將HCFs接種于96孔板，于37℃培養。24h后按以下分組全量換液：(1)浸提液組：每孔100μL 浸提液；(2)完全培養基組：每孔100μL完全培養基；(3)空白對照組：無細胞，每孔100μL完全培養基。分別于換液24、36、48、60、72h后檢測各組在570nm波長處的吸光度值(OD值)，計算細胞相對生存率(RGR)，繪制細胞生長曲線，并參照細胞毒性分級標準(表1)進行細胞毒性評級。每組設5個復孔。細胞相對生存率RGR(%)=(實驗組平均OD值-空白對照組平均OD值)/(正常對照組平均OD值-空白對照組平均OD值)×100%。

1.2.3角膜基質支架的制備將術中取出的同一患者來源的兩片角膜基質透鏡平鋪于清潔蓋玻片上，吸除周圍殘留的RPMI-1640培養基。于手術顯微鏡下，先后滴加等量(3～5μL)纖維蛋白粘合劑、凝血酶溶液于其中一片角膜基質透鏡表面，并迅速將另一片透鏡覆蓋其上，于10s內調整至兩片透鏡完全重疊。

表1 細胞毒性分級

等級RGR(%)細胞形態細胞增殖能力毒性作用0≥100細胞形態完整,貼壁良好,無細胞溶解優-180～99少于20%的細胞呈圓形,貼壁松散,無胞漿顆粒,偶見細胞溶解優-250～79少于50%的細胞呈圓形,無胞漿顆粒,可見明顯細胞溶解良+330～49少于70%的細胞呈圓形或溶解中++40～29幾乎所有細胞結構均不完整差+++

表2 培養不同時間浸提液組與完全培養基組細胞的OD值與細胞毒性評級

培養時間浸提液組(x±s)完全培養基組(x±s)RGR(%)等級毒性作用24h0.513±0.0470.524±0.08097.801-36h0.723±0.0560.662±0.057109.420-48h0.880±0.1020.844±0.107104.570-60h0.946±0.0981.040±0.07591.041-72h1.109±0.0551.204±0.34392.131-

1.2.4不同保存介質對支架的影響將36枚雙層角膜基質透鏡支架轉移至6孔板中，按照保存介質不同分為以下4組：無水甘油組、透明質酸鈉組、胎牛血清組及模擬濕房環境組(生理鹽水浸濕的棉球)。每組設置3個復孔，每孔放置3枚基質透鏡支架。將6孔板置于4℃環境保存14d，觀察并評價透鏡支架的硬度、透明度及穩定性(以開裂情況作為穩定性判斷標準)，硬度和透明度均在眼前段相機下進行直觀評判。

1.2.5不同保存溫度對支架的影響將45枚雙層角膜基質透鏡隨機分為3組，置于無水甘油中脫水，其中15枚支架于常溫(25℃)環境保存(常溫組)，15枚支架于4℃環境中保存(4℃組)，15枚支架于-20℃環境中保存(-20℃組)。14d后復水，并觀察比較3種溫度保存的支架硬度、透明度及穩定性。

統計學分析：使用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計數資料的組間比較采用Fisher確切概率法；等級資料的組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，若組間存在差異，再采用Nemenyi檢驗進行各組間的兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 HCFs的形態特征細胞種瓶后24h，大部分HCFs貼壁，約48h后可見HCFs伸展為長梭形或三角形，細胞核為圓形或橢圓形，核仁清晰，貼壁緊密，排列整齊，呈渦旋狀生長。

2.2 MTT法檢測細胞生存率倒置相差顯微鏡下可見浸提液組和完全培養基組細胞均具有正常的細胞形態，細胞貼壁良好、形狀完整，無胞漿顆粒。MTT檢測結果顯示，0～72h內浸提液組與完全培養基組細胞具有相似的增殖趨勢。浸提液組細胞培養36～48h細胞毒性評級為0級，24h內及60～72h細胞毒性評級為1級，0～72h細胞相對生存率均超過90%(表2，圖1)。按照美國藥典的毒性評級標準，RGR≥80%即可認為材料無毒。

2.3雙層角膜基質支架的構建用纖維蛋白粘合劑粘貼后的雙層角膜基質透鏡支架表面平整光滑，厚度及硬度增加，透明度良好，雙層透鏡間貼合緊密。

2.4不同保存介質對雙層透鏡支架的影響4℃保存14d后，無水甘油組9枚雙層基質透鏡支架復水后均未出現開裂情況，透明度良好，硬度較甘油保存前增加，厚度稍增加(圖2A)；透明質酸鈉組9枚支架中，3枚出現開裂，剩余6枚完整，透明度尚可，硬度較保存前下降，支架略呈水腫狀態，厚度增加(圖2B)；模擬濕房環境組9枚支架均無開裂現象，但存在不同程度的皺縮，表面粗糙不平，厚度及透明度均較保存前降低(圖2C)；胎牛血清組9枚支架全部開裂，單層基質透鏡質軟且水腫嚴重。以4℃保存14d后雙層角膜基質透鏡支架開裂情況為判斷標準，比較4種保存方式的穩定性，無水甘油和濕房保存的支架穩定性最高，均優于透明質酸鈉，而胎牛血清保存的支架穩定性最低(P<0.05，表3)。

圖1 HCFs在纖維蛋白粘合劑作用下的生長曲線。

2.5不同保存溫度對雙層透鏡支架的影響于常溫、4℃及-20℃的無水甘油中保存14d后，各組雙層角膜基質透鏡復水后硬度相似，但透明度及顏色出現明顯差異。于常溫無水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架，其中2枚保持無色透明，5枚輕微變黃但透明度尚可，8枚嚴重變黃且透明度明顯降低；于4℃無水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架，其中5枚保持無色透明，10枚輕微變黃且透明度良好；于-20℃無水甘油中保存的15枚雙層透鏡支架均保持無色透明狀態，未出現變黃情況。以保存14d后雙層角膜基質透鏡支架透明度情況為判斷標準，比較3種保存溫度的保存效果，不同溫度的無水甘油對雙層角膜基質透鏡支架的保存效果差異有統計學意義(P<0.001)，其中常溫組和4℃組間差異無統計學意義(P>0.05)，-20℃組與其余兩組差異均有統計學差異意義(P<0.05)，表明-20℃組的保存效果最佳(表4)。

圖2 不同保存介質對雙層透鏡支架的影響 A：無水甘油組，雙層角膜基質透鏡支架復水后，未出現開裂情況，透明度良好，硬度較保存前增加，厚度稍增加；B：透明質酸鈉組，透明質酸鈉中保存14d的雙層角膜基質透鏡透明度尚可，硬度較保存前降低，支架呈水腫狀態，厚度增加；C：模擬濕房環境組，模擬濕房環境保存14d的雙層角膜基質透鏡透明度欠佳，存在不同程度皺縮，表面粗糙不平，厚度及硬度均較保存前降低。

表3 不同保存介質對雙層角膜基質透鏡支架穩定性的影響 枚

組別n開裂未開裂無水甘油組909透明質酸鈉組936模擬濕房環境組909胎牛血清組990

表4 不同保存溫度對雙層角膜基質透鏡支架透明度的影響 枚

組別n-+++常溫組152584℃組155100-20℃組151500

注：-：無色透明；+：透明但輕微變黃；++：嚴重變黃且透明度降低。

3討論

角膜基質是維持角膜透明性的關鍵結構成分，因此，尋找具有類似天然角膜基質結構和生化成分的角膜基質替代物是組織工程角膜研發的重點之一[3]。理想的角膜基質支架材料應具有材料透明、良好的生物相容性、適宜的強度、良好的穩定性，可供細胞黏附、增殖和遷移等特點[4]。目前研究最多的支架材料主要有膠原及其復合物、脫細胞角膜基質、絲素蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等[5]。在多種支架材料中，脫細胞角膜基質來源于天然的角膜組織，既保留了角膜組織的結構及組成成分，還保留了上皮細胞和內皮細胞的附著位點，因此成為支架材料的理想選擇。但傳統的脫細胞基質主要來源于豬的角膜組織，存在一定的宗教及倫理學爭議，且存在感染異種疾病的風險，因此臨床實際應用受限。

Smile術的興起為角膜基質材料提供了新的來源。Smile是在角膜基質層進行兩次預設深度和弧度的掃描切削，分離透鏡前后表面后，將透鏡從小切口完整取出。取出的角膜基質透鏡前后表面光滑平整，因直接取自于人的角膜基質層，理論上保留了正常角膜基質的膠原結構、光學透明度、生物力學強度及生物相容性。單層角膜基質透鏡厚度約100μm，可承受的眼內壓有限，因此對于3mm以上(<5mm)的較大角膜穿孔，可疊加使用多層角膜基質透鏡作為支架材料，以提高支架材料的抗張強度。FS是從健康人的血漿中提取出的一種天然的生物蛋白粘合劑，呈透明凝膠狀，多用于手術中噴灑創面使組織黏附并止血[6-9]，因此可選用FS粘貼多層角膜基質透鏡，以適應不同程度角膜穿孔的抗張強度需求。為探究FS對角膜基質細胞的毒性影響，本研究將Smile來源的角膜成纖維細胞與FS浸提液共同培養72h，通過MTT法檢測細胞的增殖情況，證實FS對角膜成纖維細胞無毒性作用，具有良好的生物相容性，可用于構建組織工程角膜基質支架。FS粘貼的雙層角膜基質透鏡支架表面光滑平整，硬度增加，透明度良好，兩片透鏡貼合緊密，不易移位。

傳統的角膜保存方法主要分為短期、中期、長期及超長期保存法[10]。短期保存一般采用濕房保存的方式，保存時間較短，一般為24～48h；中期保存主要是用角膜中期保存液將角膜保存4～14d，中期保存液中一般添加有硫酸軟骨素、透明質酸鈉、自體或受體血清、青霉素及皮質類固醇等添加劑以延長保存時間；長期保存多采用器官培養法，但此法操作復雜，價格昂貴，國內應用較少；超長期保存則多采用甘油保存法，操作簡便、成本低廉，且可將保存時間延長至數年[11]。綜合考慮上述保存方式，本研究選擇無水甘油、透明質酸鈉、胎牛血清及模擬濕房環境作為角膜支架的保存介質，以探究角膜支架的適宜保存方式。通過對比不同保存介質中支架的透明度、開裂情況、硬度及厚度，證實無水甘油是雙層角膜基質支架的較佳保存介質。通過進一步對比常溫、4℃及-20℃無水甘油中保存的透鏡支架的透明度，證實-20℃是較佳保存溫度。在-20℃無水甘油中保存的角膜基質透鏡支架復水后，其硬度、厚度、透明度及穩定性均較好。

綜上所述，本研究利用FS粘貼Smile來源的角膜基質透鏡構建雙層角膜基質透鏡支架，為組織工程角膜支架材料提供了新的來源途徑。將Smile來源的角膜基質細胞與FS浸提液共培養，通過MTT法證實FS對角膜基質細胞無毒性作用，可用于構建組織工程角膜基質支架。通過對比不同保存介質、不同保存溫度下透鏡支架的穩定性、硬度及透明度，證實-20℃無水甘油是雙層角膜基質透鏡較為理想的保存條件。不僅擴充了角膜支架材料的來源，可直接用于修補3mm以下的角膜穿孔，而且為下一步聯合種子細胞構建組織工程角膜提供了前期實驗依據。