周期性饑餓再投喂對長蛸存活、生長以及肌肉脂肪酸和氨基酸的影響

宋旻鵬 汪金海 陳智威 李希豹 鄭小東

(中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

水生動物在經過一段時間的饑餓或營養不足后恢復攝食, 表現出超過其正常生長速度的現象,稱為補償生長[1,2]。補償生長是水生動物營養生理學的重要組成部分, 根據恢復生長的程度可以將補償生長分為不能補償生長、部分補償生長、完全補償生長和超補償生長四類[3], 關于其形成機制, 主要存在以下三種觀點: (1)提高自身攝食量[4]; (2)提高食物轉化率[3]; (3)既提高自身攝食量又提高食物轉化率[5]。在實際生產中, 合理的利用動物的補償生長可以有效提高飼料利用率、促進養殖動物生長、降低勞動成本以及減輕水體污染[6], 對推動科學養殖具有重要意義。目前, 水生動物的補償生長研究, 已在貝類[7,8]、魚類[9,10]、甲殼類[11,12]等水生動物中廣泛開展。

長蛸(Octopus minor)又稱八蛸、長腿蛸、章魚等, 廣布于我國南北沿海、朝鮮半島以及日本沿海海域[13], 是我國重要經濟蛸類。近年來, 許多研究人員已針對長蛸細胞生物學[14]、遺傳學[15—17]、營養學[18]、胚胎發育[19]、增養殖[20]、攝食行為學[21]等方面開展過研究, 本課題組于2017年開展了生長期長蛸的補償生長研究, 分析了在不同饑餓時間后恢復投喂對長蛸補償生長的影響[4]。在補償生長研究中, 周期性饑餓被認為是獲得理想補償生長效果的一種有效方法[6], 但關于長蛸生長期階段的周期性饑餓脅迫后的補償生長研究尚未見報道。在本研究中, 我們通過對生長期長蛸開展周期性饑餓再投喂實驗, 研究其生長、存活, 以及肌肉脂肪酸和氨基酸含量變化, 探討不同投喂模式對暫養長蛸的影響并制定出合理的投喂計劃, 旨在為我國長蛸增養殖健康發展提供參考資料和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗于2018年9—10月在山東馬山集團育苗廠內開展。選取體質健壯、外觀完好的健康長蛸[體重(94.29±9.35) g, 胴背長(53.25±5.25) mm]120只野生個體用于實驗。實驗期間采用肉球近方蟹[Hemigrapsus sanguineus, 體重(7.52±1.38) g]作為餌料。

1.2 實驗方法

實驗前馴養3d, 馴養期間對長蛸進行飽食投喂,馴養結束后開始實驗。實驗分為4組, 包括1個對照組和3個周期性饑餓再投喂組, 每組設置3個平行實驗, 每個平行10只長蛸。實驗設計如下:

對照組: 連續投喂24d;

S1F5組: 饑餓1d, 投喂5d, 持續4個周期;

S2F4組: 饑餓2d, 投喂4d, 持續4個周期;

S3F3組: 饑餓3d, 投喂3d, 持續4個周期;

實驗于長方形水泥池(6 m×1 m×0.6 m)中進行,水深0.5 m, 采用經沙濾的自然海水, 鹽度28—31 psu,水溫19.8—22.2℃。自然光照, 持續充氧, 長流水養殖, 每日吸污1次, 每3d全換水1次。采用直徑90 mm,長度700 mm的灰色PVC管為蛸巢。每日17:00投餌, 次日上午8:00清理并統計殘餌。

在實驗結束后, 分別統計各實驗組長蛸的成活率和體重。每個實驗組隨機選取3只長蛸剖取肝臟測定肝體比, 并取其腕部肌肉于液氮中保存。

(1) 成活率(SR)、增重率(WG)、肝體比(HSI)、個體攝食量(FI)計算方法

其中:N1表示實驗開始時個體數量,N2表示實驗結束時個體存活數量;Wt1和Wt2分別表示實驗開始和結束時個體體重;Wg表示個體肝臟體重,Wt表示個體體重;WS1表示投餌質量,WS2表示殘餌質量。

(2) 肌肉脂肪酸含量測定方法

將長蛸肌肉樣品冷凍干燥48h, 后使用研缽將肌肉樣品研磨成粉末狀。取長蛸肌肉樣品100 mg,加入乙酰氯-甲醇溶液(1∶20) 2 mL, 80℃條件下水浴加熱20min, 待樣品冷卻后, 加入1 mL正己烷萃取, 期間注意遮光處理。后使用氣相色譜儀(HP6890 PLUS GC型)對提取的脂肪酸進行分析, 測量結果以脂肪酸標品(SIGMA公司生產)為參照, 通過歸一法計算各個脂肪酸組分的百分含量。

(3) 氨基酸含量測定方法

稱取長蛸肌肉干粉20 mg于安培瓶中, 加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液, 充氮, 密封, 于110℃下水解24h,減壓蒸干, 加入0.02 mol/L鹽酸于10 mL容量瓶內定容。后取0.2 mL該溶液以及三乙胺、異硫氰酸苯酯各0.1 mL置于離心管中, 室溫下靜置1h, 加入400 mL正己烷, 震蕩, 靜置10min, 使用0.45 μm膜對下層溶液進行過濾, 將濾液置于氨基酸自動分析儀(SYKAM, S-433D)中以測定氨基酸組成。

1.3 數據分析

實驗數據均采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。使用SPSS 22.0軟件統計, 進行ANOVA單因素方差分析和Duncan’s多重檢驗分析, 以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 周期性饑餓再投喂對長蛸生長性能的影響

在實驗開始前, 各實驗組長蛸起始體重差異不顯著(P＞0.05; 表 1)。周期性饑餓再投喂實驗結束后, 各組長蛸終末體重差異顯著具體情況如下: S1F5組長蛸終末體重(136.70±9.24) g顯著高于對照組值(127.69±6.51) g (P＜0.05), S3F3組長蛸終末體重(118.26±6.46) g顯著低于對照組值(P＜0.05), 而S2F4組終末體重(130.45±6.78) g與對照組值差異不顯著(P＞0.05; 表 1)。實驗長蛸的成活率隨饑餓時間增長逐漸降低, 但各實驗組均與對照組差異不顯著(P＞0.05), 各組成活率分別為: 對照組(93.33±11.55)%、S1F5組(93.33±5.77)%、S2F4組(86.67±15.28)%、S3F3組(83.33±5.77)%。

表 1 周期性饑餓再投喂對長蛸生長性能的影響Tab. 1 Effects of periodical starvation-refeeding on growth performance of O. minor

2.2 周期性饑餓再投喂對長蛸增重率、肝體比、個體攝食量以及餌料效率的影響

圖 1所示, 各組長蛸的增重率隨饑餓時間的增長先上升后下降, S1F5組的增重率顯著高于對照組,S3F3組顯著低于對照組(P＜0.05), 其中增重率值最高的為S1F5組(0.46±0.10), 最低的為S3F3組(0.26±0.06)。長蛸的肝體比隨饑餓時間的增長呈現先升高后降低的趨勢(圖 1), 其中, S1F5組肝體比值顯著高于對照組(P＜0.05), S2F4組和S3F3組的肝體比值與對照組差異不顯著(P＞0.05)。具體排序為: S1F5組(0.070)＞對照組(0.062)＞S2F4組(0.059)＞S3F3組(0.052)。

圖 2所示, 實驗長蛸的個體攝食量對饑餓時間的延長呈現上升趨勢。其中, S1F5組、S2F4組以及S3F3組值均顯著高于對照組(P＜0.05)。其具體排序為: S3F3組(5.13±1.25) g＞S2F4組(5.04±0.91) g＞S1F5組(4.76±1.11) g＞ 對照組(3.34±0.81) g。與個體攝食量變化趨勢不同, 個體體重變化量呈現先上升后下降的趨勢。其中, S1F5組個體體重變化量(42.36±4.89) g顯著高于對照組值(33.78±4.39) g (P＜0.05),S3F3組值(23.93±3.73) g顯著低于對照組值(P＜0.05),S2F4組值(35.88±3.21) g與對照組值差異不顯著(P＞0.05)。

圖 1 周期性饑餓再投喂對長蛸增重率及肝體比值的影響Fig. 1 Effects of periodical starvation-refeeding on growth rate and hepatosomatic index of O. minor

圖 2 周期性饑餓再投喂對長蛸攝食量和體重變化量的影響Fig. 2 Effects of periodical starvation-refeeding on food ingestion and weight change of O. minor

表 2 周期性饑餓再投喂對長蛸肌肉脂肪酸含量的影響Tab. 2 Effects of periodical starvation-refeeding on muscle fatty acid content of O. minor

2.3 周期性饑餓再投喂對長蛸肌肉脂肪酸含量的影響

據表 2可知, 長蛸肌肉組織中共檢測出16種脂肪酸, 起始碳鏈長度為14—22, 包含6種飽和脂肪酸(SFA)和10種不飽和脂肪酸(UFA), 其中UFA包括4種單不飽和脂肪酸(MUFA)和6種多不飽和脂肪酸(PUFA)。各實驗組SFA、UFA、MUFA、PUFA、Σn-3 PUFA、Σn-6 PUFA、Σn-9 PUFA含量均與對照組差異不顯著(P＞0.05), 但S1F5組中的值與對照組相比出現了一定程度的升高, S2F4組和S3F3組中值出現一定程度的下降; S1F5組和S3F3組中C18:0的含量顯著高于對照組的值(P＜0.05); S2F4組C18:1n-7和EPA的含量顯著高于對照組的值(P＜0.05), 且EPA / DHA也顯著高于對照組(P＜0.05)。

2.4 周期性饑餓再投喂對長蛸肌肉氨基酸含量的影響

由表 3可知, 于長蛸肌肉組織中共檢測出17種氨基酸, 其中必需氨基酸9種, 非必需氨基酸8種。經數據分析發現, 僅S1F5組胱氨酸(Cys)含量顯著高于對照組(P＜0.05), 實驗組中其余氨基酸含量均與對照組差異不顯著(P＞0.05); 此外, 必需氨基酸總量(TEAA)、氨基酸總量(TAA)以及必需氨基酸總量/氨基酸總量(TEAA/TAA)均與對照組差異不顯著(P＞0.05), 但隨饑餓時間的延長TEAA和TEAA/TAA的值有逐漸升高的趨勢。

表 3 周期性饑餓再投喂對長蛸影響Tab. 3 Effects of periodical starvation-refeeding on muscle amino acid content of O. minor

3 討論

3.1 長蛸補償生長的實驗設計

在魚類養殖過程中, 補償生長被認為是一種有效的方法用于加速魚類的生長, 但由于食物短缺引發的補償生長在接近對照組生長時具有減慢的現象, 使得最終的生長量并未出現顯著的提高[22]。因此建議采用周期性饑餓再投喂的方法, 在每次補償生長減弱時重新激活, 以增加補償生長的時間[23]。目前魚類補償生長的實驗設計主要包含以下兩類:一、餌料禁食條件下產生的補償生長[24]; 二、限制餌料攝食條件下產生的補償生長[25]。在本研究中,我們采用的是第一類實驗設計, 在各組“饑餓+投喂”實驗總持續時間相等的基礎上[26], 研究不同投喂模式對長蛸補償生長的影響。在實際生產中, 長蛸的成活率會隨饑餓時間的延長逐漸下降, 設定適宜時長的饑餓脅迫對研究長蛸的補償生長具有重要的影響, 本課題組于2017年開展的長蛸饑餓實驗結果顯示, 長蛸的成活率自饑餓3d起開始呈現下降趨勢[4], 因此, 在本研究中, 我們將最長饑餓時間設定為3d。

3.2 周期性饑餓再投喂對長蛸生長的影響

目前, 補償生長的衡量指標以攝食量和餌料利用率、蛋白質合成率和能量儲備為主[27]。安琪和曾曉起[28]報道馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)的補償生長時, 因海膽殼占濕重比例較大, 將性腺指數和生化組分作為衡量標準。張濤等[26]將成活率和增重率作為無針烏賊(Sepiella japonica)補償生長的判斷標準。通過綜合前人的研究基礎, 我們將成活率、增重率以及終末體重作為長蛸補償生長的衡量標準。

在本實驗中, S1F5組與對照組相比成活率相同, 而增重率和終末體重顯著高于對照組; S2F4組中的成活率、增重率和終末體重均與對照組差異不顯著。此結果表明S1F5和S2F4組個體均具有補償生長的能力, 且S1F5組個體更具備超補償生長能力。這一結果與大麻哈魚(Oncorhynchus nerka)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)在短期饑餓脅迫下具備補償生長能力的結果一致[29,30]。同時, 我們還對長蛸的個體攝食量進行了統計, 發現各個實驗組長蛸的個體攝食量均顯著高于對照組。因此,為保證養殖長蛸在再投喂期間能充分的發揮其補償生長能力應保證充足的餌料供應。綜上所述,從節約成本, 保證養殖長蛸的成活率和生長速度的角度來看, 建議長蛸的最佳投喂模式為周期性饑餓1d再投喂5d。

3.3 周期性饑餓再投喂對長蛸肌肉組織脂肪酸和氨基酸含量的影響

在饑餓條件下, 水生動物會通過消耗自身脂肪酸來提供能量, 其脂肪酸的消耗具有一定的順序,即首先使用飽和脂肪酸, 再利用低不飽和脂肪酸,最后才動用高不飽和脂肪酸[3]。如鮸(Miichthys miiuy)幼魚和點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)幼魚在饑餓過程中, 首先利用飽和脂肪酸(SFA), 其次利用單不飽和脂肪酸(MUFA), 最后才利用多不飽和脂肪酸(PUFA)[31,32]。在本研究中, 結果顯示3個實驗組的SFA、MUFA以及PUFA的含量均與對照組差異不顯著, 從含量變化上看, 長蛸肌肉中的脂肪酸從饑餓2d后開始出現下降且首先利用的是SFA、其次為MUFA、最后才利用PUFA。作者認為肌肉脂肪酸的含量從饑餓2d后才開始下降, 這一現象可能是由于饑餓1d時間太短, 長蛸首先利用了儲存在肝臟內的營養物質, 致使肌肉中的脂肪酸含量并未減少。

氨基酸是水生動物必需的營養物質, 對維持水生動物正常的生命活動發揮著重要作用。當水生動物遭受饑餓脅迫時, 其自身能夠將氨基酸轉化為葡萄糖來提供能量, 具體表現為必需氨基酸總量和氨基酸總量的下降[33,34]。不同種類水生動物對氨基酸的利用也不盡相同, 鰻鱺(Anguilla japonica)經長期饑餓脅迫后, 必需氨基酸量和氨基酸量均顯著降低, 且必需氨基酸量較氨基酸量下降的更為明顯[35]。大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚在饑餓早期, 大多數氨基酸組分和氨基酸總量會稍微低于對照組, 但隨饑餓時間的增長, 會表現出先上升后下降的趨勢[10]。斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)在遭受饑餓脅迫時, 優先利用非必需氨基酸作為能源物質[36]。在本實驗中, 不同實驗組的TEAA總量、TAA總量以及TEAA/TAA均與對照組差異不顯著, 表明不同投喂模式對長蛸肌肉氨基酸的含量并未產生影響, 這與虎斑烏賊(Sepia pharaonis)幼體經周期性饑餓再投喂后各實驗組氨基酸含量與對照組差異不顯著的結果一致[6]。此外, 長蛸肌肉中檢測出的9種必需氨基酸和8種非必需氨基酸中, 僅Cys的含量顯著高于對照組, 這一結果與無針烏賊幼體經過周期性饑餓再投喂處理后Cys含量顯著高于對照組的實驗結果相似[26]。作者認為這一現象可能與長蛸自身的新陳代謝有關, 饑餓脅迫后降低了長蛸對該種氨基酸的需求量, 致使各實驗組的Cys含量均高于對照組, 但具體原因需進一步研究。

致謝:

感謝馬山集團有限公司蔡兵經理、王炳輝廠長、蔡輝廠長提供了實驗場地和實驗材料, 中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室2017級碩士研究生南澤參與了部分實驗工作。