綠原酸與Ⅲ型細菌素復配對雞肉中假單胞菌的抑菌機制

王虹懿 唐敏敏 吳海虹 諸永志 劉芳 孫芝蘭 徐為民 彭景

摘 要：熒光假單胞菌是引起冷鮮雞肉腐敗變質的優勢腐敗菌，可降解肉品中的蛋白質、脂肪等物質，產生多種腐敗代謝產物，進而使肉類食品風味和品質發生劣變。采用體外抑菌實驗研究綠原酸（chlorogenic acid，CA）、Ⅲ型細菌素Helveticin-M及二者復配對熒光假單胞菌的抑菌效果;通過掃描電子顯微鏡觀察不同處理對熒光假單胞菌外部形態結構的影響，通過激光共聚焦顯微鏡觀察、測定胞外ATP含量、胞外蛋白和核酸外滲，研究CA或Helveticin-M對指示菌細胞膜滲透性的影響。結果表明：與CA或Helveticin-M單獨作用相比，二者復配后抑菌作用顯著增強（P<0.05）;綠原酸與Helveticin-M復配處理可顯著破壞熒光假單胞菌形態，增強細胞膜滲透性，加劇胞內物質外泄，最終加速熒光假單胞菌死亡。

關鍵詞：綠原酸;Ⅲ型細菌素Helveticin-M;熒光假單胞菌;抑菌機制

Abstract： Pseudomonas fluorescein is the dominant spoilage bacterium in chilled fresh chicken， which can degrade protein， fat and other substances in meat， producing a variety of spoilage metabolites， which deteriorate the flavor and quality of meat. The objective of this study was to explore the antimicrobial effect of Helveticin-M， a class Ⅲ bacteriocin and/or chlorogenic acid （CA） against Pseudomonas fluorescens by in vitro experiments. The morphological structure of Pseudomonas fluorescens was observed by a scanning electron microscope （SEM）. To evaluate the effect of Helveticin-M and CA on the cell membrane permeability of the indicator strain， confocal laser scanning micrographs （CLSM） were recorded and extracellular ATP and protein contents as well as leakage of ultraviolet absorbing substances were measured. The results showed that the combined antibacterial effect of Helveticin-M and CA was markedly increased compared with either agent alone?（P < 0.05）. Furthermore， the combined treatment significantly damaged the morphology of Pseudomonas fluorescens， increased the membrane permeability， promoted the leakage of intracellular substances， and finally accelerated cell death.

Keywords： chlorogenic acid; Helveticin-M （a class Ⅲ bacteriocin）; Pseudomonas fluorescens; antimicrobial mechanism

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191009-235

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）02-0001-06

引文格式：

王虹懿， 唐敏敏， 吳海虹， 等. 綠原酸與Ⅲ型細菌素復配對雞肉中假單胞菌的抑菌機制[J]. 肉類研究， 2020， 34（2）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20191009-235.? ? http：//www.rlyj.net.cn

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雞肉是人類日常膳食中優質蛋白質的主要來源之一，營養十分豐富，但其高營養成分和高水分活度使其在加工、運輸、貯藏、銷售等過程中極易腐敗變質，品質迅速下降，影響其營養和風味[1]。而致腐微生物的生長是引起肉品腐敗變質最重要的原因，其中假單胞菌通常被鑒定為肉類優勢腐敗菌之一，假單胞菌在冷鮮肉中的生長速率比其他細菌快1/3左右[2-3]。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌，能夠在低溫環境下生長繁殖，是引起低溫貯藏條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質的優勢腐敗菌群[4-5]。此外，研究發現，熒光假單胞菌可形成對抑菌劑耐受性更強的生物膜結構[6]，大大增加了肉品保存難度。然而，近年來化學抗菌劑的濫用導致眾多食品安全事件，引起更多重視，因此開發研究新型天然防腐劑顯得尤為重要。

目前已從中草藥、果蔬、野生植物中分離出具有抗氧化活性、抑菌或殺菌活性的天然植物源防腐劑，如廣泛存在于草本植物中的多酚類物質，其酚氧化程度越高，對微生物的抑制作用越強[7-8]，將其應用在肉制品貯藏與保鮮中有延長肉品保質期的作用。綠原酸（chlorogenic acid，CA）是主要從杜仲科植物中提取出來的多酚類化合物[9]，是具有生物抑菌活性的天然植物源抑菌劑[10]。研究發現，CA對銅綠假單胞菌[11]、大腸桿菌[12]、金黃色葡萄球菌[13-14]等均具有良好的抑制作用。

本課題組前期通過異源表達及提取純化方法獲得高純度的Ⅲ型細菌素Helveticin-M，并分析了該細菌素的抗菌活性和作用機理，但是Helveticin-M仍存在抑菌活性較低的問題。研究表明，將2 種抗菌性能互補的抗菌物質聯合使用時二者的抗菌活性可顯著增強[15]。例如，將聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素在酸性條件下協同使用不僅降低了單獨使用量，而且能夠更加高效地抑制腐敗菌生長[16]。

本研究將CA和Helveticin-M復配使用，對二者抑制

P. fluorescens的效果及協同抑菌機理進行深入研究，為CA聯合Helveticin-M應用于P. fluorescens的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細菌素Helveticin-M 本課題組前期從大腸桿菌中表達分離純化;供試菌株（P. fluorescens） 本課題組自主從冷鮮雞肉中分離篩選得到;CA（杜仲提取物，純度98%） 陜西慧科植物開發有限公司;LIVE/DEADTM BacLightTM熒光染色試劑盒 美國Invitrogen公司;增強型ATP檢測試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

JY5002電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;UniCenMR臺式高速冷凍離心機 德國Herolab公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SPX-250B-Z生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Gen5全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;Ultra View VOX激光掃描共聚焦顯微鏡 美國珀金埃爾默公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國Carl Zeiss公司;SW-CJ-1FD無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌素Helveticin-M的克隆表達與純化參照文獻[17]。

1.3.2 細菌生長情況測定

將過夜活化2 次的P. fluorescens以體積比2%的接種量接入LB培養基中，分別添加終質量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL Helveticin-M以及二者的混合物

（2.5 mg/mL CA+200 μg/mL Helveticin-M），添加相同體積的0.01 mmol/L PBS作為空白對照組，置于30 ℃、200 r/min搖床培養。每隔1 h測定600 nm波長處光密度（optical density，OD600 nm），繪制生長曲線，分析P. fluorescens經不同處理后的生長情況。

1.3.3 CA與Helveticin-M對細菌細胞形態的影響

采用掃描電鏡法觀察P. fluorescens經不同處理后細胞外部形態的變化。將過夜活化2 次的P. fluorescens以接種量2%接入LB培養基中，收集對數生長期的菌液，8 000 r/min離心10 min，用PBS洗滌重懸，制成107 CFU/mL的菌懸液;將菌懸液分裝，分別加入終質量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M及二者復配溶液，加入相同體積PBS為空白對照，于30 ℃、200 r/min處理3 h后，6 000 r/min離心10 min，用PBS沖洗后在體積分數2.5%戊二醛溶液中固定，2 500 r/min、4 ℃離心10 min，加入1 mL超純水，放置10 min后再次離心，重復3 次，將樣品分別用體積分數50%、70%、80%、90%的乙醇溶液按順序依次洗脫，每次放置15 min，離心，加入100%乙醇后放置30 min，最后將菌泥固定于鏡片上，在通風櫥中風干、噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態變化[18-20]。

1.3.4 CA與Helveticin-M對細菌細胞膜滲透性的影響

1.3.4.1 激光共聚焦顯微鏡觀察

利用LIVE/DEAD試劑盒中的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料和SYTO-9染料進行活/死菌標記。按照1.3.3節中的方法制備菌懸液，并分組處理3 h。分別取菌懸液100 μL于10 000 r/min離心2 min，重懸在100 μL PBS中，加入LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒中的熒光染料各3 μL進行染色，37 ℃黑暗條件下孵育30 min后離心，用PBS沖洗3 次，最終用200 μL PBS重懸菌體;吸取2 μL菌懸液于載玻片，觀察并拍照[21]。

1.3.4.2 胞外ATP含量測定

取1.3.4.1節所述處理后的菌懸液于30 ℃、200 r/min搖床培養0、30、60、90、120、180 min后12 000 r/min離心，取上清液置于冰上待用。采用熒光標記法，具體操作步驟參照增強型ATP檢測試劑盒說明書，用酶標儀通過檢測熒光值確定ATP含量。

1.3.4.3 胞外蛋白質量濃度及核酸水平測定

收集對數生長期的P. fluorescens菌體沉淀，用5 mL PBS洗滌3 次，最后用5 mL PBS重懸制成菌懸液，將菌懸液分裝為4 份，分別加入終質量濃度為2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M和二者復配溶液，添加相同體積的PBS作為空白對照，30 ℃、200 r/min培養，分別于0、2、4、6、8、12 h取樣，菌懸液8 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，用考馬斯亮藍法通過檢測595 nm波長處的吸光度對樣品蛋白質質量濃度進行測定（添加Helveticin-M的樣品需設置空白對照扣除蛋白質本底）[22]。核酸在260 nm波長處有較強的吸收值，因此通過測定260 nm波長處的吸光度（A260 nm）來推測胞外核酸水平的變化[23]。

3 結 論

為探究CA與Helveticin-M復配作用后對P. fluorescens的抑菌效果及損傷機理，研究不同處理對P. fluorescens生長情況、細胞形態和細胞膜滲透性的影響。結果表明：與CA或Helveticin-M各自單獨作用相比，CA和Helveticin-M復配處理對P. fluorescens的抑菌效果最為顯著，通過掃描電鏡觀察發現，P. fluorescens菌體形態受損最為嚴重，胞體扭曲凹陷甚至瓦解;由于CA與Helveticin-M互補作用于菌體細胞膜，細胞膜完整性遭到破壞，進一步增強了細胞膜的滲透性，加劇誘導胞內ATP、蛋白質和核酸物質的外泄，隨著胞內物質釋放，菌體細胞逐漸裂解，最終抑制P. fluorescens的正常生長代謝。

本研究采用抑菌劑復配作用于P. fluorescens，既降低了抑菌劑的最低有效劑量，又顯著增強了抑菌效果，為天然防腐劑在肉品保鮮貯藏中的應用提供了理論支撐。目前，已有許多研究表明，不同抑菌物質聯合作用時抗菌活性顯著增強，但其抑菌機制尚未明了。本研究初步闡明CA與Helveticin-M對P. fluorescens的作用機制，但研究局限于純菌條件下的影響，未來的研究期望能夠進一步詳細研究其對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的作用機制，擴大其在食品中的應用范圍。

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