青錢柳葉片中總黃酮的提取方法研究

董安強 張哲 黃玉敏

摘要 [目的]研究青錢柳葉片中總黃酮的提取方法。[方法]通過超聲波輔助水醇提取法提取總黃酮，以乙醇濃度、料液比、超聲波功率密度、提取時間為考察因素，以得到的總黃酮含量為指標，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，研究青錢柳葉片中總黃酮的最佳提取條件。[結果]提取青錢柳葉子中總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度70%、料液比1∶80（g∶mL）、超聲波功率密度為50%、提取時間40 min，在此條件下總黃酮提取率為2.95%。[結論]該研究為工業生產提取總黃酮提供了參考依據。

關鍵詞 青錢柳;葉片;總黃酮;超聲波輔助水醇提取;正交試驗

中圖分類號 R284.2 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0179-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.050

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to study the extraction method of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Method]The total flavonoids were extracted by ultrasonicassisted hydroalcoholic extraction method，taking ethanol concentration， materialliquid ratio， ultrasonic power density and extraction time as factors， and using the obtained total flavonoids as an index， an orthogonal test was performed on the basis of the single factor test to study the optimal extraction conditions of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Result]The optimal extraction conditions for total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves were： ethanol concentration of 70%， materialliquid ratio of 1∶80， ultrasonic power density of 50%， and extraction time of 40 minutes. Under these conditions， the total flavonoid extraction rate was 2.95%. [Conclusion]The research provides a reference for extracting total flavonoids for industrial production.

Key words Cyclocarya paliurus;Leaves;Total flavonoids;Ultrasoundassisted wateralcohol;Orthogonal test

青錢柳（Cyclocarya paliurus）屬于雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬，該屬下只有青錢柳一種，零散分布于中國南部山區，目前屬國家重點保護的瀕危植物之一[1]。青錢柳葉中富含的水提物和醇提物（黃酮），能夠有效地調節人體糖代謝，激活胰島器官功能，可以起到降血糖的作用[2]。對于黃酮的提取方法主要有索氏提取法、有機溶劑提取法、微波提取法[3]、超臨界流體萃取法[4]、超聲波輔助提取法等。超聲波輔助提取法提取黃酮類物質，是目前比較新的方法。超聲波是一種具有波動與能量雙重屬性的機械波，它是利用超聲波所具有的熱效應、機械效應、空化效應，通過增大介質的穿透力、增大介質分子的運動速度來提取生物有效成分，可以加快提取進程，促進植物體中有效成分的溶解，提高藥物有效成分的提取率[5-7]。該試驗采用超聲波輔助提取法對青錢柳葉片中總黃酮進行提取，以期研究出最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 試材

青錢柳新鮮葉子;蘆丁標準品（安徽酷爾生物工程有限公司）;無水三氯化鋁（天津市大茂化學試劑廠）;無水乙醇;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

SB-5200 DTD 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;UV-5100紫外可見分光光度計（METASH上海元析儀器有限公司）;粉碎機（COSUAI永康市天祺盛世工貿有限公司）。

1.3 標準曲線的繪制

準確配制0.3 mg/mL 蘆丁標準液和1%的三氯化鋁乙醇溶液，用80%乙醇定容。精確吸取0.3 mg/mL蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于1～6號10 mL容量瓶中，待用;在1～6號容量瓶分別加入1 mL 1%的三氯化鋁乙醇溶液，用80%乙醇定容，放置15 min。1號管為對照組。該試驗中，樣品在415 nm波長有最大吸收峰，因此選擇415 nm作為測定波長。用1號溶液對分光光度計進行調零，隨后分別對2～6號溶液進行3次測定，記錄每次的吸光度，最后分別取平均值;以蘆丁濃度（X）對吸光度（Y）作圖，得出回歸方程為Y = 30.091X-0.030 8（R.2=0.998 9）。

1.4 試驗方法 在單因素試驗的基礎上，采用L9（3.4）正交設計，以青錢柳總黃酮的提取率為指標，探討乙醇濃度、料液比、超聲波功率密度、提取時間4個因素對提取率的影響。

試驗流程：新鮮青錢柳葉子→干燥→粉碎→稱取樣品→按照料液比加入提取液（不同濃度的乙醇）→超聲波提取→過濾→定容→測定。

測定方法：往樣品中加入螯合劑（1%三氯化鋁乙醇溶液），放置15 min后，在415 nm波長的分光光度計下測定各樣品吸光度，記錄吸光度，分別取平均值;由回歸方程求出稀釋液中總黃酮濃度，然后計算青錢柳總黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助水醇提取青錢柳葉總黃酮單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。在超聲波清洗儀功率密度75%、提取時間30 min、料液比為1∶20時，考察不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對青錢柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖1可以看出，在試驗條件下，當其他提取條件固定時，乙醇的濃度越高，總黃酮的量就越多，在用60%～80%的乙醇濃度提取時，總黃酮提取率的變化趨勢比較平緩，說明提取的用量已經接近飽和狀態。結合經濟效益，提取總黃酮的乙醇濃度以60%為最優選擇。

2.1.2

料液比對總黃酮提取率的影響。在超聲波清洗儀功率密度75%、提取時間30 min、乙醇濃度60%時，考察不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100）對青錢柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖2可以看出，在試驗條件下，當其他提取條件固定時，隨著料液比的提高，總黃酮提取率先隨之升高，當料液比為1∶60時，總黃酮提取率最大，之后有所下降。推斷原因是增加溶劑的劑量時，增大了溶質推動力，有利于黃酮類物質的溶出，青錢柳總黃酮提取率明顯提高，當溶劑量繼續增多時，雜質成分溶出增多，影響了黃酮類物質的浸出，故隨后的總黃酮提取率有所下降。提取液量過少不利于后期過濾工作，黃酮損失率也較大[8]。因此選擇料液比1∶60為最佳。

2.1.3 超聲波清洗儀功率密度對總黃酮提取率的影響。在料液比1∶40、提取時間30 min、乙醇濃度60%時，考察不同超聲波清洗儀功率密度（50%、60%、70%、80%、90%）對青錢柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖3可以看出，在試驗條件下，當其他提取條件固定時，超聲波清洗儀功率密度為60%和70%時，總黃酮提取率達到最大值。分析其原因是一開始隨著功率密度的增加，對細胞壁的破壞作用逐漸增強，這促進了總黃酮的溶出，使其提取率逐漸增加，但當功率密度大于70%時，引起局部高溫，會破壞總黃酮的結構，使其提取率下降。因此超聲波清洗儀功率密度選擇60%為宜。

2.1.4?提取時間對總黃酮提取率的影響。在料液比1∶40、超聲波清洗儀功率密度為75%、乙醇濃度60%時，考察不同提取時間（10、20、30、40、50 min）對青錢柳葉片總黃酮提取率的影響。從圖4可以看出，當其他提取條件固定時，提取時間為40 min時，總黃酮提取率最大，之后有所下降。分析其原因在于提取的前期，細胞內總黃酮快速擴散到溶劑中，使得其提取率顯著增加。大于40 min后，由于長時間的超聲波機械效應和熱能效應對總黃酮結構產生破壞，同時又造成細胞內其他雜質擴散進入溶劑中，使得總黃酮提取率下降。因此提取時間選擇40 min為宜[9]。

2.2 正交試驗對提取方法參數的優化

單因素試驗是在各個因素相互不影響的情況下所得到的結論，但實際提取的過程中所存在的變量都是相互影響的，利用單因素試驗結果選取正交試驗的最優范圍，方便試驗數據的整理，故在單因素試驗的基礎上，采用L9（3.4）正交設計，進行正交試驗，設計參數為乙醇濃度、料液比、超聲波清洗儀功率密度、提取時間4個參數（表1）;設計梯度參照單因素試驗的代表梯度，以青錢柳葉總黃酮提取率為指標進行提取方法參數的優化。

從表2可以看出，超聲波輔助提取青錢柳葉總黃酮過程中的各個變量因素影響程度不同，各因素的影響程度從大到小依次為料液比、提取時間、乙醇濃度、超聲波清洗儀功率密度。正交試驗所得最佳條件為A3B3C2D1，即料液比1∶80，乙醇濃度為70%，提取時間為40 min，超聲波功率密度為50%，在此提取條件下，總黃酮的提取率為2.95%。

3 結論與討論

關于青錢柳葉子中總黃酮的提取方法報道較少，該試驗對總黃酮的提取方法進行研究，對比傳統的酶解法提取[10]，超聲波輔助水醇提取法所運用的化學物質少;對比超臨界流體萃取法，其操作簡單;對比索氏提取法，超聲波輔助水醇提取法所運用的時間更短。超聲波輔助水醇提取法適用于食品工業生產，安全且成本較低，操作容易。

單因素試驗表明，各個因素在相互不影響的情況下提取青錢柳葉片中總黃酮的最佳條件為乙醇濃度60%、料液比1∶60、超聲波功率密度為60%、提取時間為40 min。但實際提取的過程中所存在的變量都是相互影響的，故利用單因素試驗結果選取正交試驗的最優范圍進一步進行了正交試驗。正交試驗結果表明，料液比的影響最大，其次是提取時間、乙醇濃度，超聲波清洗儀功率密度的影響最小。超聲波功率太強或者提取時間過長均會影響總黃酮的穩定性，導致提取率降低。提取青錢柳葉片中總黃酮的最佳條件為乙醇濃度70%，料液比1∶80，超聲波功率密度為50%，提取時間為40 min，在最佳提取條件下，總黃酮的最終提取率為2.95%。

參考文獻

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