薏苡黑穗病快速檢測方法研究

王健 楊成龍 楊小雨

摘要 以薏苡黑穗病菌粉胞內蛋白為免疫原，制備抗體，建立薏苡黑穗病ELISA檢測方法。結果表明，測定純化后抗體的最高效價為1∶800 000，具特異性強;方陣試驗測定抗原的最佳包被濃度為10.3 CFU/mL，抗體的工作濃度為1∶4 000;優化ELISA檢測條件，確定抗體4 ℃過夜（8～12 h）包被效果最好，選擇1%酪蛋白作為抗體的封閉液，抗體的最佳封閉時間為 1.5 h，抗體的最佳孵育時間為2.5 h，最佳底物作用時間為15 min;建立ELISA標準工作曲線，表明抗體的靈敏度為10.4 CFU/mL。ELISA檢測田間采集的黑穗病病葉顯示，抗體可與病葉提取液發生特異性反應，而與健康葉提取液呈陰性反應，由此可確定黑穗病的存在與否。該方法可用于田間薏苡黑穗病快速檢測，以及時指導病害防治。

關鍵詞 薏苡黑穗病;抗體;酶聯免疫反應

中圖分類號 S435.19 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）05-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.056

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract The antibody was prepared by the immunogen with the intracellular protein in Coix lacrymajobi smut fungus powder， and the ELISA detection method was established. The results showed that the titer was 1∶800 000 of the purified antibody，which had high specific.The square matrix test to determine the optimal coating concentration of the antigen was 10.3 CFU/mL， and the working concentration of the antibody was 1∶4 000;the optimization ELISA detection conditions were antigen blocked for night （8-12 h） at 4 ?℃， 1% cottomin of the assay buffer blocked for 1.5 h， antigen incubated for 2.5 h， the reaction time of coloration was 15 min. The standard curves of ELISA was established，which showed that the antibody sensitivity was 10.4 CFU/mL.ELISA detection of smut diseased leaves collected in the field showed that the antibody could be specific reaction with the extracted solution of disease leaves，and it be negative reaction with extracted solution of healthy leaves， which could confirm the presence or absence of smut.The method can be applied to detect cucumber bacterial white spot disease in field and direct the disease control in time.

Key words Coix lacrymajobi smut;Antibody;ELISA

薏苡（Coix lacrymajobi L.）是我國重要的藥糧兼用的經濟作物，具有極高的營養價值。薏苡在我國分布廣泛，主產貴州、廣西、云南、福建等省[1]。目前，貴州省薏仁米種植面積、產量均居全國第一，生產量占全國2/3[2]。貴州省各地薏苡種植分散，生產以農民自留當地農家種為主，種植區域沒有實行合理布局，難以實現產業化、規?；?，導致薏苡病害多發，尤其是由薏苡黑穗病最為嚴重，可使產量下降30%～50%，嚴重時減產80%[3-5]。

近年由于薏苡品種雜亂，導致黑穗病對薏苡的生長危害日趨嚴重，嚴重影響薏苡的產量和品質，對農戶的經濟收入造成嚴重的影響以及制約薏仁米產業的發展。對薏苡感黑穗病后建立快速檢測的方法報道較少，而采用建立酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）技術檢測早期薏苡感染黑穗病的方法鮮見報道，至1976年首次采用應用于植物病毒檢測[6]后，該方法被用于植物、動物、醫學上對病原菌及農藥殘留等快速檢測的有效手段[7-9]，該技術方法為一類通過固相載體進行酶聯免疫染色的免疫酶標，其特點具有特異性較強、高靈敏度、易操作、快速準確，對于生產上常規方法難以檢測的病害具有獨特優勢。目前國內采用ELISA 技術成功檢測各種病害，孫艷秋等[10]建立ELISA方法對黃瓜細菌性白枯病菌檢測結果表明抗體的靈敏度為10.5 CFU/mL;Tsuchiya等[11]制備了番茄和辣椒細菌性斑點病菌的單克隆抗體;寧紅等[12]用I-ELISA方法檢測水稻細菌性條斑病菌，通過ELISA測定靈敏度可達10.3～10.4 CFU/mL。該研究以薏苡黑穗病菌菌絲蛋白作為免疫原，制備了多克隆抗體，并建立了快速靈敏的薏苡黑穗病ELISA檢測體系，為進一步進行針對薏苡黑穗病的快速檢測試劑盒的研究奠定了基礎。

2.3 建立間接 ELISA 方法的標準曲線

將薏苡黑穗病菌粉配成不同濃度按“2.2.2”和“2.2.3”優化條件進行間接 ELISA 方法測定，以黑穗病菌粉液濃度對數為橫坐標、抑制率為縱坐標繪制標準曲線，評價其靈敏度;檢測結果顯示（圖6），薏苡黑穗病菌粉在60%～75%線性關系良好，即抗體的檢測線性范圍為 10.3～10.5 CFU/mL，所以該方法對薏苡黑穗病的檢測靈敏度為 10.4 CFU/mL。

2.4 采用ELISA方法檢測薏苡黑穗病病葉樣品

采用ELISA 方法對薏苡黑穗病病葉的提取液進行檢測，將提取液包被酶標板4 ℃過夜處理8～12 h后，以1%酪蛋白封閉液進行封閉處理，置于 37 ℃恒溫箱中溫育封閉l.5 h，加入薏苡黑穗病菌抗體和病葉提取液，再放入 37 ℃恒溫箱中孵育 2.5 h，加入稀釋4 000倍的HRP-羊抗兔IgG后再次放入?37 ℃恒溫箱中孵育2.5 h，最終加入底物基質液反應15 min后終止反應并測定 OD490。結果表明（表2），病葉提取液的 P/N為 4.8，對照健康葉片提取液為陰性反應，表明建立的改良 ELISA 方法可準確檢測出病葉中的薏苡黑穗病病菌。

3 小結與討論

關于植物病原真菌的血清學檢測中，一般可以將抗體分為2種，分別為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb） 是由一個B淋巴細胞產生，針對一種抗原決定簇的抗體[15]， 因具有特異性強、穩定性高、可無限量生產等優點，但真菌結構與物質組成極為復雜，尋找具有特異性抗原極其困難[16-17]。而多克隆抗體（polyclonal antibody，PAb）是由多種抗原決定簇刺激機體后相應地產生多種多樣的單克隆抗體，把這些單克隆抗體組合在一起就稱為多克隆抗體，雖其在某些情況下特異性不如單克隆抗體，但具有制備時間短、制備方法簡單便捷、成本較單克隆抗體費用低的特點，所以仍被廣泛研究和應用于生物、醫學等領域對病原微生物的檢測[18]。

近年來，在薏苡種植生產中存在的問題有品種單一、優良品種少、品種退化等問題日益突出，導致薏苡抗性差、病害多發，其中以薏苡黑穗病最為嚴重，嚴重制約了薏苡產業的發展，該病系由擔子菌亞門黑粉菌屬冬孢子引起的全株系統性真菌病害[3，19]，病斑最早出現在分蘗期的葉片上，一般在植株抽穗期病情大規模暴發，防治極其困難，對已發病的植株生產上暫無特效藥劑進行防治，因此建立一套早期檢測薏苡黑穗病的方法勢在必行。目前，一般采用分子生物技術對一些常規病害進行檢測，但因其成本高與使用精密的儀器，對操作者的要求較高，而且一般局限于實驗室使用，而ELISA方法的操作相對簡單快捷，具有特異性好、靈敏度高、成本低等優點，而且可以開發成試劑盒的形式，更適用于大規模田間樣品的檢測與基層推廣。該研究以薏苡黑穗病菌菌絲與菌粉的胞內蛋白為抗原，獲得了黑穗病菌的多克隆抗體，效價分別為1∶450 000與1∶800 000，具有非常理想的效價與特異性。目前已報道ELISA的靈敏度一般為10.5～10.6 CFU/mL，對于鑒定常規病害的病原菌是足夠的[20]，該試驗最佳的抗原抗體工作濃度已確定，并對各項反應條件進行初探優化，同時對建立的 ELISA 方法進行了薏苡黑穗病病葉的檢測，采用10.4 CFU/mL對供試植物病原菌檢測P/N為 4.8>2.1，而健康葉片呈陰性反應P/N<2.1，可見其特異性較好，結果準確可靠，為薏苡黑穗病快速診斷提供了有效的技術手段，具有良好的應用前景。

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