羊肚菌真菌病害調查及分離鑒定

鄭旋 向準 康超 李鵬 汪建文 楊彝華

摘 要 對貴州省龍里縣羊肚菌開展真菌病害調查、采集與分離純化，運用形態學鑒定和rDNA-ITS序列分子檢測法構建系統發育樹。共分離鑒定了18個真菌病原菌菌株，屬于木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、鐮刀菌屬（Fusarium）和阿太菌屬（Athelia）等。

關鍵詞 羊肚菌;真菌病害;分離鑒定

中圖分類號：S567.34 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.21.066

羊肚菌（Morchella importuna）隸屬于羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）[1]，因其菌蓋表面凹凸不平形似羊肚，又被稱為羊肚菜、羊肚蘑，是一種珍貴食藥用菌[2]。近年來，隨著羊肚菌產業的擴大發展，栽培管理中病蟲害問題日趨明顯[3]，其中由真菌病原菌引發的競爭（侵染）性病害最為嚴重，造成羊肚菌減產甚至失收[4]。本研究通過羊肚菌真菌病害調查和分離鑒定，了解羊肚菌真菌病害發生情況和病原菌類別，為羊肚菌防治病害提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年1月，在貴州省龍里縣灣灘河鎮羊肚菌種植基地開展真菌病害調查，以3～5個大棚為調查重點，每個大棚隨機采集有明顯真菌病害特征的羊肚菌子實體、營養袋和栽培土壤標本，記錄發病時間和病害特征等信息，標本編號并裝入密封袋內，迅速帶回實驗室進行分離、培養、鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化

在超凈工作臺上，用滅菌過的接種針從樣品病害部位挑取1小塊置于PDA培養基平板上，于25 ℃恒溫避光培養3～5 d，挑取菌落尖端菌絲于PDA培養基上培養，重復3～5次。將純化后的菌絲轉入斜面試管培養，于

4 ℃冰箱內保存。

1.2.2 病原菌形態鑒定

在超凈工作臺上，用滅過菌的接種針從保存的病原菌株上各挑取少量菌絲，分別接種于PDA平板培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。每隔1 d觀察菌落形態和菌絲生長情況等。

1.2.3 病原菌分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌菌株DNA，用引物5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3擴增菌株DNA基因的ITS序列，PCR反應采用25 μL反應體系。PCR循環條件為：94 ℃預變性4 min;擴增30個循環（94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃延伸10 min。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測序結果在GenBank數據庫中進行Blast比對分析。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌真菌病害調查

在調查的羊肚菌栽培大棚內，共采集病害樣品9份，病害特征調查結果為：羊肚菌子實體顏色變深，不同程度萎蔫、畸形，蛛網狀白色菌絲自下而上侵染，包裹整個子實體，幼菇停止發育;菌柄顏色偏紅，菌蓋畸形發育呈近圓球形，頂部有白色霉層，并產生白色孢子粉;菌蓋萎蔫形成孔洞，孔洞邊緣有白色霉層。營養袋內有粉紅色至紫色、綠色黑色霉菌污染。白色病菌菌絲自菌袋底部向周圍土壤侵染蔓延，覆蓋營養袋周圍栽培土壤，后期菌絲侵染整個廂面，顏色加深，廂面上無羊肚菌生長。

2.2 病原菌菌落形態特征

分離純化采集的9份病害樣品，共獲得18個真菌病原菌菌株，分別對18個真菌病原菌菌株進行菌落形態特征觀測，結果如圖1所示。

2.3 病原菌分子鑒定及系統發育樹

將18個真菌病原菌菌株的ITS序列在GenBank中進行Blast序列分析

3 討論

調查顯示，因栽培土壤處理不當或培養料滅菌不徹底，真菌在適宜環境下迅速生長，與羊肚菌菌絲爭奪營養、水分、氧氣和空間，導致羊肚菌子實體生長不良或停止生長[5-6]。其中，深綠木霉（T.atroviride）和綠木霉（T.virens）為常見食用菌栽培中的木霉雜菌，總狀毛霉（M.racemosus）為常見的食用菌栽培中的毛霉雜菌，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）可能為羊肚菌鐮刀菌病或霉菌性枯萎病的病原菌[7-8]。在羊肚菌栽培過程中，土壤表面出現大量白色菌絲，可能為阿太菌，梨采后阿太菌易發，此次是首次從食用菌病害中分離得到的[6]，在食用菌上還未見其致病報道，對所得結果還需進一步驗證。

參考文獻：

[1] 吳興亮，卯曉嵐，圖力古爾，等.中國藥用真菌[M].北京：科學出版社，2013.

[2] 敬華英.羊肚菌種屬鑒定及活性成分保健功效研究進展[J].安徽農業科學，2018，46（14）：34-36.

[3] 劉偉，張亞，何培新.羊肚菌生物學與栽培技術[M].長春：吉林科學技術出版社，2017.

[4] 宋金俤，曲紹軒，馬林，等.食用菌病蟲識別與防治原色圖譜[M].北京：中國農業出版社，2013.

[5] 劉正慧，李丹，等.食用菌主要病原真菌和細菌[J].菌物研究，2018，16（3）：158-163.

[6] 賈曉輝.梨采后阿太菌果腐病病原學及其致病機制研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2019.

[7] 吳小平.食用菌致病木霉的鑒定、致病機理及防治研究[D].福州：福建農林大學，2008.

[8] 余苗，尹琪，何培新.羊肚菌白腐病病原菌的分離與鑒定[J].北方園藝，2020（7）：142-145.

（責任編輯：劉昀）