柑橘AN1 基因(CsAN1)在檸檬酸積累中的作用及不同因素對其表達的影響

楊文萱，羅麗娟，陳 歡，柳東海，劉永忠

華中農業大學 園藝林學學院，湖北 武漢 430070

檸檬酸作為柑橘果實中的主要有機酸，是決定柑橘果實風味的關鍵因素，在拉動消費者購買力方面具有重要作用，而如今市場上的柑橘檸檬酸含量過高，口感酸澀不佳，加之柑橘種植面積廣，群眾對柑橘品質要求較高，大量柑橘滯銷嚴重，造成了資源的極大浪費。因此，本試驗認為研究檸檬酸積累對調控柑橘果實風味具有非常重要的意義。

PH5是細胞質膜上的一種P 型ATP 酶基因，具有決定液泡pH 的功能[1]。而CsPH8是PH5的同源基因，前期研究認為它極有可能調節柑橘果實液泡中的檸檬酸積累[2]。2016 年Verweij 等[3]提出一個調控PH5的模型：AN11-AN1-PH4形成復合體調控PH3轉錄，然后PH3 翻譯蛋白又與AN11-AN1-PH4復合體結合調控PH5 的轉錄，本課題組寧東媛[4]分別從柑橘基因組中克隆了調控CsPH8的CsAN1、AN11、PH3和PH4基因，發現紅暗柳中的CsAN1在CsPH8低表達中可能起到非常重要的作用。

AN1是bHLH 家族轉錄因子，參與花青素合成，且可調節花瓣中液泡酸化和種皮細胞的大小及形態[5]。Bianchi，et al[6]發現，AN1等位基因并不穩定，極易受外界各種因素影響，當溫度由18°C升高至25°C 時，參與花青素合成的AN1等位基因表達水平大幅下降，矮牽牛花瓣的斑點密度顯著增加。但是，關于CsAN1與檸檬酸關系的研究卻鮮見報道，對于何種外界各種因素影響CsAN1的表達仍不明確。因此，研究CsAN1在柑橘檸檬酸積累中的作用以及探討不同因素對該基因表達影響及調控檸檬酸積累具有重要意義。

本課題基于以上背景，以不同品種為材料分析了CsAN1、CsPH8的表達水平和有機酸含量以探討三者之間的關系，并且在離體與活體兩種條件下，分析不同條件對CsAN1表達的影響。通過研究，初步明確CsAN1的表達水平與檸檬酸積累之間的關系，以及不同因素對CsAN1的表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的處理與培養基

1.1.1 實驗材料的處理 華中農業大學基地果園的暗柳橙（Citrus sinensis cv.Anliu）和紅暗柳橙(HL,C.sinesnsiscv.Honganliu)分別于盛花后124、146、165、186、207 d 采收。離體處理的國慶1 號溫州蜜柑（C.unshiu cv.GuoqingNo.1）和華柑2 號椪柑（C.reticulata cv.HuaganNO.2）來自華中農業大學園林樓，時期為花后94 d，進行汁胞組織培養。活體處理中礦質元素處理的國慶一號溫州蜜柑來自華中農業大學花果山基地，選取三棵溫州蜜柑果樹，編號為1、2、3。1 號果樹施用氮肥，選取枝干A、B。A 枝干作為對照，噴灑0.005 mol/L 的礦物油；B 枝干噴灑0.5%的尿素和0.005 mol/L 礦物油所配溶液。2 號果樹施用磷、鉀肥，選取枝干A1、B1、C1、D1。A1 噴灑0.003 mol/L 的尿素，B1噴灑0.003 mol/L 的尿素和0.005 mol/L 的鉀肥（K2SO4），C1 噴灑0.003 mol/L 的尿素和0.004 mol/L的磷肥（Na2HPO4），D1 噴灑0.003 mol/L 尿素、0.004 mol/L 的磷肥（Na2HPO4）與0.005 mol/L 的鉀肥（K2SO4），3 號果樹，選取枝干A2、B2、C2、D2。A2 枝干噴灑0.005 mol/L 礦物油枝干作為對照；B2 枝干分別噴灑0.005 mol/L 的Ca(NO3)2·4H2O 和0.005 mol/L 礦物油，C2 噴灑0.005 mol/L 的CaCl2溶液和0.005 mol/L 礦物油，D2 噴灑0.005 mol/L 的CaSO4·2H2O 溶液和礦物油。15 d 噴灑一次，30 d 后采收。活體覆膜處理的實驗材料同樣是種植于華中農業大學花果山的國慶一號溫州蜜柑果樹。隨機選取一棵果樹的三條枝干。一條枝干作為空白對照，第二條枝干覆黑色遮陽網，第三條枝干覆上白色防蟲網，7 d 后采收果實。活體ABA 注射處理，一條枝干的果實進行ABA 注射，另外一條枝干的果實作為對照，14 d 進行一次注射，處理30 d。以上實驗材料采收后，均分離汁胞混勻，液氮冷凍，-70°C 超低溫冰箱保存。

1.1.2 離體培養基配制 大量元素母液配制除礦質元素處理外，其他離體培養處理均為正常取值，配置體系如表1 所示。微量元素母液配制：KI 0.083 g、CuSO4·5H2O 0.0025 g、H3BO30.62 g、CoCl2·6H2O 0.0025 g、ZnSO4·7H2O 0.86 g、Na2MoO4·2H2O 0.025 g、MnSO4·4H2O 2.23 g，1000ml 蒸餾水溶解上述藥品，裝瓶定容。有機母液配制：肌醇10 g、鹽酸硫胺素(VB1)0.01 g、煙酸(VB6)0.05 g、甘氨酸0.2 g、鹽酸吡哆醇（VB5）0.05 g，1000 mL 蒸餾水溶解上述藥品，裝瓶定容。MS 鐵鹽母液配制：依次稱取Na2·EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）3.73 g、FeSO4·7H2O(七水硫酸亞鐵)2.78 g，配成1L 母液。MS 培養基配制：大量元素100 mL、鐵鹽10 mL、有機母液10 mL、微量元素10 mL、蔗糖30 g、pH 5.85、8 g 瓊脂，加熱溶解，調節pH，分裝后121 ℃高壓滅菌15～20 min。

表1 大量元素母液配制體系Table 1 Large amount of element mother liquor preparation system

1.2 實驗方法

試驗采用離體培養與活體處理相結合的方式進行，活體處理包括覆膜處理、礦質元素（氮肥、磷鉀肥、鈣肥）處理、ABA 注射處理，均于華中農業大學進行，設置對照組，處理30 d，測定相關生理指標；離體培養采用配制培養基進行汁胞組織培養的方式進行，包括礦質元素處理、溫度處理。礦質元素處理為N、P、K、Ga、Mg，各分兩組不同質量的處理組，均設置10 d，20 d，30 d 3 個時間階段，測定相關生理指標；溫度處理中，椪柑設置4°C、25°C、35°C 3 個處理組，溫州蜜柑設置4°C、15°C、25°C、35°C 4 個處理組，處理時間均為5 d、15 d、30 d 3 個階段，測定相關生理指標。

1.3 測定項目

1.3.1 可滴定酸含量的測定 利用酸堿滴定法測定可滴定酸含量[7]。

1.3.2 檸檬酸含量的測定 參照胡小梅[8]學位論文繪制檸檬酸定性分析方法和標準曲線（2015），測定檸檬酸含量。

1.3.3 基因CsAN1與CsPH8的qRT-PCR 表達分析 總RNA 的提取按照參照艾德萊TRIpure Reagent總RNA 提取試劑盒方法，進行柑橘果肉汁胞的RNA 提取方法，稍作改動。使用的cDNA 合成試劑盒為TRAN 公司的TransScript One-step g DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 試劑盒，分兩步合成cDNA。編碼柑橘的AN1基因CDS 序列在柑橘基因組數據庫中挖掘發現，AN1基因的片段引物根據分析結果設計克隆編碼，使用Primer 5.0 對所得到的保守序列設計qRT-PCR 的引物，隨后在武漢天一輝運有限公司合成，定量反應體系如表1，定量反應條件見表2。Actin 基因為實時定量分析中的內參基因，序列見表3，參考雷頓（2010）的方法。

表2 定量反應體系Table 2 Reaction system of quantitative real-time PCR

表3 定量反應條件Table 3 Reaction conditions of quantitative real-time PCR

表4 定量分析所用引物Table 4 List of primers of quantitative real-time PCR

1.2.4 數據分析 本實驗的數據整理和初步分析主要運用WPS Spredsheets 軟件進行，繪圖軟件運用Sigmaplot 12.5 與WPS Spredsheets，SAS Studio 軟件進行差異顯著分析。

2 結果分析

2.1 柑橘果實發育過程中CsAN1 與CsPH8 的表達、檸檬酸與可滴定酸含量變化

測定了盛花后124、146、165、186、207 d 里暗柳橙和紅暗柳橙果實汁胞中的CsAN1與CsPH8的表達水平、檸檬酸及可滴定酸含量，結果如圖1 所示。

圖1 柑橘果實發育過程中CsAN1 與CsPH8 基因表達、檸檬酸與可滴定酸含量變化Fig.1 The changes of CsAN1 and CsPH8 gene expression,citric acid and titratable acid content during citrus fruit development

如圖1A 所示，暗柳橙果實汁胞中的檸檬酸含量在這5 個時期分別為2.58 mg.g-1FW，3.99 mg.g-1FW，4，65 mg.g-1FW，3.88 mg.g-1F 和3.89 mg.g-1FW，紅暗柳橙果實汁胞中的檸檬酸含量分別為1.15 mg.g-1FW，0.92 mg.g-1FW，0.97 mg.g-1FW，0.18 mg.g-1FW 和0.18 mg.g-1FW。暗柳與紅暗柳中，檸檬酸含量均呈現先升高后降低的趨勢，并在盛花后165 d 左右達到高峰值，但暗柳中的檸檬酸含量明顯遠遠高于紅暗柳。

如圖1B 所示，暗柳橙在花后124、146、165、186、207 d 的可滴定酸含量分別為0.57%，0.57%，0.69%，0.68%和0.65%，紅暗柳橙果實汁胞中的可滴定酸含量分別為0.18%，0.13%，0.11%，0.11%和0.09%。顯然，果實發育過程中，暗柳橙中的可滴定酸含量要遠高于紅暗柳橙中的可滴定酸含量。

本實驗測定了CsAN1與CsPH8在暗柳橙和紅暗柳橙汁胞發育過程中的表達情況，如圖1C 與1D。結果顯示，在暗柳橙與紅暗柳橙果實發育期間，CsAN1在這兩種柑橘汁胞中的表達水平呈現逐漸上升的趨勢，并在花后165 d 時達到高峰。在花后165 至207 d，CsAN1在暗柳中的基因表達水平呈現逐漸下降的趨勢，紅暗柳橙中的CsAN1表達水平也呈現微弱的先升高后降低的趨勢，且暗柳橙中的CsAN1表達水平明顯高于紅暗柳橙。此外，實驗發現CsPH8在暗柳橙與紅暗柳橙果實發育期間的表達趨勢與CsAN1相似，且CsPH8在紅暗柳橙中的表達極低，說明CsAN1與CsPH8可能存在相關性。

2.2 活體處理中礦質元素對CsAN1 表達及可滴定酸含量的影響

實驗測定了4 種不同種類的鈣肥對溫州蜜柑果實中可滴定酸及CsAN1的表達水平。結果如圖2A與2B 所示，對照組、氯化鈣、硫酸鈣及硝酸鈣處理組的溫州蜜柑果實可滴定酸含量分別為1.68%，1.94%，1.82%，1.66%。可滴定酸含量最高的氯化鈣處理的CsAN1的表達水平也最高，可滴定酸含量排第2 位的硫酸鈣處理組CsAN1的表達水平與對照組無明顯差異，可滴定酸含量排第3 位的對照組與硫酸鈣處理組在CsAN1的表達水平上無顯著差異，然而可滴定酸含量較低的硝酸鈣處理組對照組相比CsAN1的表達水平顯著升高，但顯著低于氯化鈣處理組。

磷鉀對照組（P、K 對照）和施加鉀肥（0.5%K）、磷肥（0.4%P）、磷鉀混合肥（0.5%K+0.4%P）的3 個處理組溫州蜜柑果實可滴定酸及CsAN1的表達水平，結果如圖2C 與2D 所示，磷鉀對照組與0.5%K、0.4%P、0.5%K+0.4%P 處理組的可滴定酸含量分別為2.22%，1.92%，1.90%，1.85%。施加P 或K 均可使果實中可滴定酸含量顯著降低，其中可滴定酸含量最高的對照組所對應的CsAN1的表達水平也同樣最高，可滴定酸含量排第二位的0.5%K 及0.4%P 處理組的CsAN1的表達水平同樣也排第二位，而0.5%K+0.4%P 處理組可顯著下調CsAN1的表達水平并降低可滴定酸含量。

實驗測定了氮對照組與0.5%N 處理組的溫州蜜柑果實可滴定酸含量及CsAN1的表達水平。實驗結果如圖2E 與2F 所示，氮對照組與0.5%N 處理組的可滴定酸含量分別為1.52%和1.75%。0.5%N處理組中的可滴定酸含量與CsAN1的表達水平均顯著高于氮對照組，可滴定酸含量與CsAN1的表達水平成正相關性。

圖2 礦質元素對CsAN1 表達及可滴定酸含量的影響Fig.2 The effects of mineral elements on CsAN1 expression and titratable acid content

2.3 覆膜處理中溫州蜜柑果實中可滴定酸含量及CsAN1 的表達影響

圖3 覆膜處理（覆膜對照、白色防蟲網、黑色遮陽網）中的CsAN1 的表達水平及可滴定酸含量Fig.3 Relative expression level ofCsAN1and titratable acid in mulching treatment(film control,white insect net,black shade net)

由圖3A 與3B 可以看出，可滴定酸含量依次為1.9484%，2.5166%和1.968%，覆膜處理可以提高CsAN1的表達水平和可滴定酸含量，其中黑色遮陽網處理組的可滴定酸含量和CsAN1的表達水平均為最高；白色防蟲網處理組可滴定酸含量與基因表達水平排第二，且處理組與對照組之間差異顯著。由此推斷，覆膜處理的CsAN1表達水平與可滴定酸含量存在相關性。

2.4 ABA 注射對溫州蜜柑果實可滴定酸含量及CsAN1 和CsPH8 表達影響

實驗測定了ABA 注射后處理組與對照組的溫州蜜柑果實汁胞中CsAN1與CsPH8的表達水平、可滴定酸含量。實驗結果如圖4A、4B、4C 所示，ABA 注射處理組的可滴定酸含量高于對照組，差異顯著。就CsAN1與CsPH8的表達量而言，ABA 注射處理組同樣明顯高于對照組，即CsAN1與CsPH8基因表達水平呈現相似的表達趨勢。

圖4 ABA 注射處理組及對照組中CsAN1 與CsPH8 的基因表達水平及可滴定酸含量Fig.4 The Gene expression level and titratable acid content ofCsAN1andCsPH8in ABA injection treatment group and control group

2.5 離體處理中溫度處理對CsAN1 的表達影響

通過qRT-RCR 技術，實驗測定了不同溫度處理組中的椪柑與溫州蜜柑果實汁胞中CsAN1的表達水平。實驗結果如圖5A 與5B 所示，總體上，不論是在椪柑還是溫州蜜柑果實汁胞中，CsAN1隨溫度的升高而逐漸下調表達，且趨勢明顯。在椪柑果實汁胞中，由4°C 升高至25°C 時，CsAN1的表達水平在第10 d 和第15 d 里均顯著下調，而由25°C 升高至35°C 時，CsAN1的表達水平在第5 d顯著下調，而之后無明顯變化；在溫州蜜柑果實汁胞中，由4°C 升高至15°C 及15°C 升高至25°C時，CsAN1均持續顯著下調表達，而由25°C 升高至35°C 時，CsAN1下調表達不顯著。

圖5 CsAN1 在不同溫度處理組中的基因表達分析Fig.5 The Gene expression analysis of CsAN1 in different temperature treatment groups

2.6 離體處理中礦質元素處理對CsAN1 的表達影響

通過qRT-RCR 技術，實驗測定了不同含量礦質元素（2N 與1/2N、2Mg 與1/2Mg、2Ca 與1/2Ca、2P 與1/2P、2K 與1/2K）的溫州蜜柑果實汁胞中CsAN1的表達水平。實驗結果如圖6 所示，總體上，2Mg、2Ca、2N 處理組中的CsAN1的表達水平分別顯著高于1/2Mg、1/2Ca、1/2N 處理組（除第20 d的Ca 處理和第30 d 的N 處理中，2Ca、2N 處理與1/2Ca、1/2N 處理相比，CsAN1分別下調表達以外），如圖6A、6B 與6F 所示。而2P 處理組中的CsAN1的表達水平顯著低于1/2P 處理組，2K 處理組在30 d 時CsAN1的表達水平低于1/2K 處理組，其他時期差異不顯著，如圖6C 與6D 所示。

圖6 礦質元素處理對溫州蜜柑果實CsAN1 的表達影響Fig.6 The effects of mineral element treatment on the expression of CsAN1 in Satsuma Orange

3 結論與討論

3.1 CsAN1 影響CsPH8 基因調控檸檬酸含量的探討

CsAN1編碼bHLH 蛋白，并參與花青素合成等多種相關代謝途徑的調控，其中就包括直接調控矮牽牛PH5的表達，從而酸化花瓣中的液泡。CsPH8作為PH5的同源基因，是細胞質膜上的一種P型ATP 酶基因，具有決定液泡pH 的功能[1]。本試驗發現，暗柳橙和紅暗柳橙果實發育過程中，檸檬酸含量、CsAN1及CsPH8基因表達水平的動態變化趨勢一致；對溫州蜜柑果實進行ABA 注射處理，發現汁胞中CsAN1及CsPH8的表達水平同樣呈現相似的表達趨勢，與本課題組寧東媛[4]的推測相吻合，此外，覆膜處理與礦質元素處理中的CsAN1表達水平與可滴定酸含量普遍呈現近似正比的關系，根據Verweij 等[3]提出的PH5的調控模型，推測其主要原因可能是上游的CsAN1影響了下游CsPH8的表達，進而影響果實細胞液泡內的檸檬酸積累，使得檸檬酸含量、CsAN1及CsPH8的表達水平動態變化趨于一致。

3.2 礦質元素的效應

氮肥可增加果實的有機酸含量，并且果實內的檸檬酸含量也會隨施氮量的增加而顯著增加[9]；磷素通過抑制檸檬酸合成、促進檸檬酸分解的共同作用，從而達到降低果實中的檸檬酸含量的目的[10]；鉀離子通過影響果實中液泡的滲透壓和pH 值，調節果實中的有機酸含量[11，12]；梁和等[13]在柑橘的研究中發現，噴灑鈣肥可提高果實發育過程中中性轉化酶的活性，促進果實中有機酸轉化和糖積累；此外，合理施鎂還可明顯提高非揮發性有機酸含量[14]。本研究結果表明，過量的礦質元素，鎂肥、氮肥、鈣肥有上調CsAN1基因表達和增加有機酸含量的作用，而磷肥與鉀肥有下調CsAN1基因表達和降低有機酸含量的作用。因此，推測合理施用氮、磷、鉀、鈣、鎂，可以提高有機酸含量與CsAN1基因表達水平，但具體的肥料用量和施用時期等還需深入研究。

3.3 樹冠覆膜效應

四川盆地的一些椪柑、臍橙和雜柑進行調查后發現樹冠覆膜后可滴定酸含量輕微提高，本研究中，覆蓋黑色遮陽網或白色防蟲網，均會使得果實中CsAN1的表達顯著上調，并且可滴定酸含量也有提高，與李明娟等[15]研究結果相似。也有研究表明，紐荷爾臍橙[16]、清見桔橙[17]和沙糖桔[18]在留樹貯藏過程中酸含量逐漸降低，而樹冠覆膜可延緩這種變化[19]。與前人研究結果的差異，可能與栽培地的氣候和覆膜材料有關，曾有實驗證明，覆膜不嚴，有雨水滲入也會使結果相差較大[20]。

3.4 脫落酸（ABA）效應

ABA 是一種高效的生長調節抑制劑，一般來說，干旱、寒冷、高溫、鹽漬和水澇等逆境條件都能使植物體內ABA 含量迅速增加，同時抗逆性增強[22，23]。植物中存在三種質子泵，即V 型質子泵[V-H+-ATPase（VAP）]、F 型質子泵（VHA 和VHP）和質模型質子泵[P-H+-ATPase（PHA）][24]，PH5即為細胞質膜上的一種P 型ATP 酶基因，具有決定液泡pH 的功能[1]。Shi 等[2]發現ABA 注射可以顯著上調CsPH8表達，且證實了CsPH8可調節柑橘果實液泡中的檸檬酸積累。本研究結果也表明，在柑橘果實汁胞中注射ABA，可顯著上調CsAN1與CsPH8的表達，增加檸檬酸含量，似乎是ABA注射激活了CsAN1的表達和P 型ATP 酶的相關活性，進而促進了檸檬酸積累。

3.5 溫度效應

前人研究表明環境條件變化會對基因結構產生影響。AN1基因座由結構基因和監管區域構成，其中的結構基因決定花青素合成反應中的相關酶活性，監管區域決定著結構基因的位置、活化時間和活化速率[6]，而當轉座因子插入基因座后可以誘導監管區域突變，產生不穩定的AN1等位基因，等到突變修復后又產生了不穩定等位基因的回復[21]。由于酶必須參與基因的回復與逆轉，因此，人們猜測AN1等位基因回復率易受溫度影響。Doodeman 等[21]在環境因素對矮牽牛AN1等位基因逆轉率的影響中發現當溫度從18°C 升高到25°C 時，參與花青素合成的AN1等位基因表達大幅下降，本實驗研究結果表明，當溫度從4°C 升高至35°C 時，會顯著下調CsAN1基因表達水平，其原因可能是溫度影響修復所涉及的酶的活性，因此影響回復率，使得CsAN1明顯下調表達。