獼猴從幼年到老年的卵巢組織學變化*

田 川 楊再玲 朱向情 李 曄 呂冠柯 王金祥 趙 晶 蔡學敏 潘興華

(1. 貴州醫(yī)科大學，組織工程與干細胞實驗中心，貴陽 550004)(2. 解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室，云南省細胞治療技術轉化醫(yī)學重點實驗室，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，昆明 650032)

卵巢衰老是一個多因素相互作用，逐漸累積的復雜生物學過程，主要表現(xiàn)為卵母細胞數(shù)量和質量下降[1]。女性的生育能力隨著年齡的增長而自然下降，30～35歲婦女的生育力下降速度緩慢而穩(wěn)定，35歲以后，由于卵巢儲備和卵母細胞質量和數(shù)量的下降，女性的生育力下降速度將加速[2]。目前，卵巢衰老的治療方法主要有激素替代[3]和細胞因子治療[4]等，但都存在各自的缺點，如引發(fā)心血管疾病等，不能從根本上解決卵巢衰老導致的不孕不育等問題。主要是因為卵巢衰老和女性與年齡相關的生育力下降的分子機制仍不清楚[5]。非人類靈長類動物是揭示年齡如何塑造卵巢的理想模型，因為它們的生物組成與人類高度相似，并且不易受混雜因素影響[6]。獼猴與人類的生理性及衰老特征相似，基因相似度90%以上，可作為一種特別有希望用于衰老研究的模型生物。有研究發(fā)現(xiàn)獼猴和人類之間存在廣泛共享的免疫衰老的mRNA表達和DNA甲基化修飾[7]。因此，用獼猴作為卵巢衰老的研究對象，觀察獼猴的卵巢組織從幼年到老年的變化規(guī)律，可為卵巢衰老的臨床研究提供更充足的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物:所用實驗動物為健康雌性獼猴，由中國科學院昆明動物研究所提供幼年雌猴3只，平均年齡3歲，體質量2～3 kg；青年獼猴3只，年齡7～9歲，體質量4.5～7 kg；老年雌猴3只，年齡23～27歲，體質量4～7 kg。所有獼猴均飼養(yǎng)于中國科學院昆明動物研究所，飼養(yǎng)期間環(huán)境清潔衛(wèi)生，動物籠具清潔干燥，達到動物飼養(yǎng)標準，實驗動物生產許可證號SYXK(軍)2012-0039，所有動物研究經依托單位實驗動物倫理委員會批準，批件號為倫審2019-032(科)-01。

1.2 主要實驗試劑與器材

通用型中性組織固定液、HE染液、Masson 染液(Servicebio)；Tunel 試劑盒(Vazyme)；鼠抗人CD34(美國BD公司)；無水乙醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)；DAPI(Servicebio)；中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司；脫水機、包埋機、凍臺均購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機和組織攤片機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱購自上海慧泰儀器制造有限公司；脫色搖床購自谷歌生物；IX70-121倒置相差顯微鏡購自Olympus公司；冰凍切片機購自Thermo公司；離心機購自上海安停儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1動物分組與分離卵巢:篩選的幼年獼猴、青年獼猴與老年獼猴各3只在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)2周，觀察各組獼猴無異樣變化后，用過量3%戊巴比妥鈉(1 kg/mL)麻醉獼猴使其安樂死，首先暴露腹腔，找到卵巢位置，卵巢隨陰道、輸卵管一起取出，用鑷子和手術剪剝離卵巢，無菌紗布拭干卵巢周圍血跡，電子天平稱質量(g)并拍照，再用鑷子和手術剪把卵巢橫向等比分成4份，約1 mm3左右，最后把卵巢放至4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.3.2卵巢組織HE染色:取卵巢組織進行常規(guī)石蠟切片制作，HE染色，顯微鏡下觀察卵巢組織結構變化。

1.3.3卵巢組織Masson染色:首先，石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精 5 min，自來水洗3次。再將切片浸至 Masson A 液中浸泡過夜，次日用自來水洗3次。 同時，配制Masson B液與Masson C液等比混合液，切片浸染1 min后，用自來水洗3次，隨后1%鹽酸酒精分化，自來水洗3次。再將切片置于Masson D液中，浸染6 min，自來水漂洗3次，Masson E液浸染1 min，Masson F液染20～30 s。然后，切片用1%冰醋酸漂洗分化，兩缸無水乙醇脫水。接著透明封片：切片放入第3缸無水乙醇5 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。最后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.4卵巢組織Tunel染色:冰凍切片固定：將冰凍切片水平置于37 ℃烘箱烘烤15 min，4%多聚甲醛中固定 30 min，隨后脫色搖床上用 PBS(pH 7.4)洗滌 3 次，5 min/次。修復：用組化筆在組織周圍畫圈，以防止液體流走，在圈內滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃溫箱孵育25 min。再在脫色搖床上用PBS洗滌 3 次，5 min/次。破膜：向在圈內滴加破膜工作液以覆蓋組織，室溫孵育20 min，再用PBS洗滌3次，5 min/次。標記：用去離子按1∶4的比例水稀釋試劑盒內5×Equilibration Buffer，滴加1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢測樣本區(qū)域，室溫孵育 10 min。加反應液：參照說明書，將Recombinant TDT Enzyme、BrightRed Labeling Mix、5×Equilibration Buffer和去離子水按1∶5∶10∶34混合，混合液緩慢滴加到圈內以覆蓋組織為止，隨后將切片平放于濕盒內，37 ℃恒溫箱孵育2 h。DAPI 復染細胞核：切片用 PBS洗滌3次，5 min/次。充分吸去PBS后，在圈內滴加 DAPI 染液，室溫避光孵育10 min。封片：切片用PBS洗滌3次，5 min次。隨后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.5卵巢免疫組織化學染色: 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min，雙蒸水洗3次。抗原修復：組織切片放在EDTA抗原修復液中，然后在微波爐內中火8 min，停火8 min，轉至中低火7 min進行抗原修復，在室溫冷卻后，玻片用PBS中洗滌3次，5 min/次。畫圈與血清封閉：用組織筆在組織周圍畫圈，然后滴加BSA孵育30 min。加一、二抗：吸去封閉液，加一抗(1∶3 000)，孵育過夜，PBS中洗滌3次后， 5 min/次。加入二抗室溫避光孵育50 min。自發(fā)熒光淬滅：向圈中央滴加抗熒光淬滅封片劑封片。DAPI復染細胞核：在圈內滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min。封片：切片用PBS洗滌3次，5 min/次，再滴加抗熒光淬滅封片劑進行封片，最后鏡檢送掃描。血管計數(shù)：參照Weidner 等校對計數(shù)方法，先在低倍鏡下掃查整個切片，尋找3個血管高密度區(qū)，即“熱點”；然后在×200下計數(shù)染色呈陽性的血管數(shù)，對于微血管的識別不需具備完整的管腔和紅細胞，只要有明顯的血管內皮細胞染色、并且能與相鄰的血管、腫瘤細胞以及間質成分相分隔的，就可視為一個獨立的血管，分辨不清以及具有較厚肌層的血管不納入計數(shù)內；計數(shù)3個視野下血管數(shù)目平均值作為 MVD 值(個/HP)，然后以Graphpad prism 5.0統(tǒng)計分析軟件對所得數(shù)據進行分析(P<0.05)。

2 實驗結果

2.1 幼年、青年、老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)

卵巢臟器指數(shù)為卵巢質量與獼猴體質量的比值，其大小可以反映卵巢的萎縮及其他退行性改變。幼年獼猴的卵巢臟器指數(shù)與青年獼猴的無顯著差異，都顯著高于老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)(圖1)。

圖1 獼猴卵巢臟器指數(shù)統(tǒng)計圖注：**P<0.01Fig.1 Statistics of ovarian index of macaquesNote:**P<0.01

2.2 卵巢組織HE染色

由圖2可知，幼年獼猴卵巢可見原始卵泡(黑色箭頭)、初級卵泡(藍色箭頭)、次級卵泡(紅色箭頭)、成熟卵泡(綠色箭頭)、閉鎖卵泡(紫色箭頭)，青年獼猴卵巢可見原始、初級、次級、成熟卵泡，老年獼猴卵巢局部只見閉鎖卵泡，被大量脂肪組織填充(黃色箭頭)。幼年與青年獼猴卵巢實質比例顯著高于老年獼猴。

圖2 卵巢組織HE染色(200 μm)Fig.2 HE staining of ovarian tissue(200 μm)

2.3 卵巢組織Masson染色

由圖3可知，Masson染色可以反映卵巢組織的纖維化，圖中藍色為膠原纖維，紅色為肌纖維、纖維素與紅細胞。幼年獼猴卵巢在皮質區(qū)有少量膠原纖維沉積，大量纖維素與紅細胞。青年獼猴在髓質與皮質區(qū)有少量膠原纖維沉積，排列稀疏，不規(guī)律。老年對照組膠原纖維在髓質和間質中都沉積有大量膠原纖維，沉積面積大，排列縝密且紊亂，局部可見少量肌纖維、纖維素與紅細胞。對膠原纖維所占面積比進行分析,結果顯示老年獼猴最高(P<0.01)，青年獼猴低于幼年獼猴(P<0.05)。

圖3 卵巢組織Masson染色(50 μm)注：*P<0.05，**P<0.01Fig.3 Masson staining of ovarian tissue (50 μm)Note：*P<0.05，**P<0.01

2.4 卵巢組織Tunel染色

由圖4可知，Tunel染色中凋亡細胞被染成紅色，細胞核為藍色。幼年獼猴卵巢與青年獼猴卵巢中幾乎沒有細胞凋亡；老年獼猴的卵巢大部分細胞染成紅色。對凋亡細胞占比進行分析，結果顯示幼年獼猴卵巢的細胞凋亡率與青年獼猴的無顯著差異，老年獼猴卵巢的細胞凋亡率最高(P<0.01)。

圖4 卵巢組織Tunel染色(100 μm)注：**P<0.01Fig.4 Tunel staining of ovarian tissue(100 μm)Note：**P<0.01

2.5 卵巢組織免疫組織化學染色

利用免疫組織化學染色法來標記CD34以分析卵巢組織中的血管個數(shù)，CD34表達于血管內皮細胞，被標記后染成紅色。對CD34陽性顆粒及血管個數(shù)進行統(tǒng)計分析，結果顯示幼年獼猴卵巢血管個數(shù)為160，青年獼猴卵巢血管個數(shù)為109，老年獼猴血管個數(shù)76(圖5)。

圖5 卵巢組織免疫組織化學染色(50 μm)注：*P<0.05，**P<0.01Fig.5 Immunohistochemical staining of ovarian tissue(50 μm)Note：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

隨著社會和經濟的發(fā)展，晚婚晚育現(xiàn)象越來越普遍，各種誘因導致高齡女性卵巢衰老不孕不育的人數(shù)越來越多。目前針對卵巢衰老的治療多為性激素替代，細胞因子治療和中醫(yī)治療等，但都治標不治本，其原因主要是卵巢衰老的關鍵調控機制不完全清楚，探索新的治療方法依然是需要研究的重點。獼猴屬于非人類靈長類動物，其衰老特征和卵巢組成與人類相似，以獼猴為卵巢衰老研究對象，觀察獼猴的卵巢從幼年到老年的組織結構變化，實驗結果將更接近于對女性卵巢衰老的研究。

幼年獼猴的卵巢臟器指數(shù)與青年獼猴的無顯著差異，都顯著高于老年獼猴的卵巢臟器指數(shù)，提示獼猴到了老年后卵巢體積逐漸萎縮。女性生殖(卵巢)衰老的特征是由于卵泡和卵母細胞的質量和數(shù)量顯著下降，生殖功能明顯降低[8]。隨著卵巢衰老，卵泡池逐漸減少，卵母細胞質量下降[9]。本實驗HE結果顯示，幼年獼猴卵巢組織中有大量的原始與初級卵泡，青年獼猴卵巢中的初級卵泡與次級卵泡數(shù)量下降，出現(xiàn)較多的次級卵泡，部分卵泡發(fā)育成熟，老年獼猴卵泡閉鎖，出現(xiàn)閉鎖卵泡，有大量脂肪組織填充。說明隨著年齡的增長，獼猴卵巢卵泡逐漸被消耗，最后發(fā)生閉鎖。

纖維化過度積累會破壞組織結構和功能，包括心臟，肺和腎臟在內的多個器官均表現(xiàn)出與年齡相關的纖維化[10]。Masson 染色結果顯示，幼年獼猴卵巢皮質區(qū)有少量膠原纖維沉積，大量纖維素與紅細胞。青年獼猴髓質與皮質區(qū)有少量膠原纖維沉積，排列稀疏，不規(guī)律。老年獼猴髓質和間質中都沉積有大量膠原纖維，沉積面積大，排列縝密且紊亂，局部可見少量肌纖維、纖維素與紅細胞。可見，獼猴從幼年到青年階段纖維化程度逐漸減弱，而后從青年到老年階段纖維化程度逐漸增加。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢纖維化具有增加CD206+∶CD68+的細胞比例，CD8+T細胞浸潤和纖維化DPP4+αSMA+成纖維細胞[11]。有研究證明纖維化是卵巢間質衰老的早期標志，這種微環(huán)境的改變可能導致與年齡相關的配子質量下降[10]。卵巢纖維化是卵巢成纖維細胞過度增殖和細胞外基質沉積導致，許多細胞因子，如MMPs、TGF-β1與VEGF都參與了卵巢纖維化[12]。在幼年和老年人的非人類靈長類動物卵巢的單細胞轉錄組學研究中，鑒定了卵巢中7種具有不同基因表達特征的卵巢細胞，包括卵母細胞和7種類型的卵巢體細胞[13]。可見，幼年獼猴卵巢的纖維化程度高于青年獼猴卵巢的纖維化，可能是由于獼猴在幼年期卵巢，胸腺等器官未完全發(fā)育成熟，抗炎癥、氧化應激與免疫調控等能力不足，不能及時修復卵巢損傷，導致局部發(fā)生纖維化。隨著年齡增長，到了青年階段，獼猴各個器官發(fā)育完全，免疫調控與抗炎等能力逐漸增強，使得纖維化減弱。到了老年階段，獼猴整體器官功能發(fā)生退變，卵巢纖維化增加導致獼猴卵巢功能下降，結構被破壞。

卵泡閉鎖是哺乳動物卵巢中顆粒細胞和卵母細胞丟失以及卵巢早衰的主要過程，研究表明，顆粒細胞凋亡會導致卵泡閉鎖[14]。本研究中，Tunnel 染色結果顯示幼年獼猴卵巢的細胞凋亡率與青年獼猴的凋亡率無顯著差異，老年獼猴卵巢的細胞凋亡率最高。也有結果表明，衰老的卵泡間質細胞產生的與衰老相關的分泌表型相關的細胞分泌趨化因子配體可能通過促進顆粒細胞凋亡而在卵巢衰老過程中損害卵泡的發(fā)育和成熟[15]。可見，老年獼猴的卵巢大量卵泡發(fā)生閉鎖，可能是由于卵巢細胞凋亡增加引起的。

血管隨著年齡的增長而丟失，與年齡有關的血管丟失是特定于區(qū)域的，并且可以至少部分地通過對毛細血管堵塞的區(qū)域敏感性來解釋[16]。本研究的實驗結果顯示幼年獼猴卵巢血管個數(shù)為160，青年獼猴卵巢血管個數(shù)為109，老年獼猴血管個數(shù)76，提示獼猴卵巢血管個數(shù)在幼年時最多，然后逐漸退化甚至丟失。有研究發(fā)現(xiàn)小血管疾病的危險因素可通過削弱毛細血管功能來減少組織氧合，衰老和血管危險因素會損害白質過高灌注和毛細血管功能，從而造成缺氧組織損傷，繼而影響其消耗的白質束的功能和代謝需求[17]。推測獼猴卵巢血管個數(shù)增齡性減少，可能會導致卵巢供血及營養(yǎng)因子不足，從而發(fā)生卵巢組織損傷，結構被破壞。

綜上所述，獼猴從幼年到老年，卵泡逐漸被消耗，間質區(qū)排列散亂，髓質區(qū)被脂肪組織填充。卵巢纖維化程度從幼年到青年階段減弱，青年以后纖維化程度逐漸增強。卵巢細胞凋亡率從幼年到青年階段無顯著差異，青年到老年階段細胞凋亡率上升。卵巢組織中的血管從幼年開始以后逐漸退化甚至丟失。推測獼猴卵巢組織結構和卵泡從幼年到老年的變化趨勢，可能是通過纖維化與卵巢細胞凋亡率增加，血管個數(shù)減少來調控的，但是具體的調控機制還需要進一步的研究。