iRhom2Uncv小鼠乳腺發育障礙的轉錄組分析*

尚艷姣 周小軍 郭子瀟 袁 征

(軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心，北京 100071)

乳腺在激素的刺激下可分泌乳汁，乳腺發育障礙影響泌乳功能。影響小鼠乳腺發育的原因主要有兩方面，一方面是激素，包括雌激素、催乳素、孕激素和它們的下游旁分泌效應子[1]，催乳素和雌激素協同促進導管延伸、分叉和小葉腺泡形成。激素分泌不足，直接影響乳腺管的生長發育及乳腺末端的分枝，從而使乳腺發育受到影響。另一方面，除了經典的激素調節乳腺發育，還有生長因子、受體酪氨酸激酶、細胞外基質分子和蛋白酶也參與這個重要過程[2]。雙調蛋白(amphiregulin, Areg)是乳腺導管的延伸最重要的旁分泌介導者[3]。Areg 敲除小鼠在青春期乳腺導管發育受阻。

iRhom2Uncv小鼠是我單位培育的一種BALB/c遺傳背景的突變小鼠[4]。該小鼠純合子表型之一為毛囊分化障礙。前期研究工作表明iRhom2Uncv純合子的雌鼠乳腺側枝導管發育障礙，喪失泌乳功能，但相關機制尚不明確。本研究擬對iRhom2Uncv小鼠乳腺組織的進行轉錄組測序，對影響乳腺發育障礙相關的基因進行鑒定和功能分析，為深入研究iRhom2Uncv小鼠表型特征以及延展該小鼠模型在其他領域的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級iRhom2Uncv和野生型小鼠為本中心生產繁育。實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2017-0014。

1.2 樣品采集

各取5只12周齡的野生型(WT)和iRhom2Uncv純合雌鼠，彎頭鑷夾取小鼠眼球，EP管收集血液，用于ELISA分析。其中3只采用斷頸法處死后迅速解剖，取新鮮乳腺組織進行whole-mounts染色分析。另一部分新鮮乳腺組織放入RNase-free的離心管中，在液氮中速凍后置于-80 ℃保存，用于轉錄組分析。

1.3 Whole-mounts染色

將上述新鮮乳腺組織鋪在玻片上，用體積比1∶3的冰醋酸/100%乙醇混合物固定、水化，0.2%洋紅(Sigma)和0.5%的AlK(SO4)2過夜染色，在梯度乙醇中脫水，用體積比1∶2的苯甲醇/苯甲酸芐酯(Sigma)透明，利用Olympus IX51顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 轉錄組測序和生物信息學分析

轉錄組測序由諾禾致源公司進行，具體步驟包括：利用RNeasy mini kit(Qiagen)提取野生型和iRhom2Uncv小鼠乳腺組織總RNA，用Oligo Magnetic Beads分離mRNA，隨后將其打斷成250～300 bp的短片段，以片段化的RNA為模板，隨機寡核苷酸為引物合成cDNA第一條鏈。采用NEBNext Ultra TM RNA Library Prep Kit(New England Biolabs)構建文庫，質檢合格后，在Illumina Hiseq X ten平臺進行PE150測序。下機原始數據經過數據過濾、測序錯誤率檢查及GC含量分布檢查，獲得有效測序數據(clean reads)。采用Tophat2將有效測序數據比對到小鼠參考基因組上，利用Stringtie拼接轉錄本，并對其進行表達水平定量。最后用Cuffdiff軟件分析表達差異的顯著性，P<0.05為顯著差異。

1.5 ELISA分析

采用美國Bio Vision的Prolactin(mouse/rat)ELISA Kit(cat. No K4688)和Estrogen(mouse)ELISA Kit 10/16(cat. No K4265-100)測定小鼠血清中的催乳素和雌激素水平。

2 結果

2.1 乳腺發育形態

Whole-mounts染色分析結果顯示，相比于野生型小鼠(圖 1A)，出生12周iRhom2Uncv雌鼠的乳腺導管分叉較稀疏(圖 1B)，導管側枝發育明顯存在障礙。

圖1 小鼠乳腺形態注：A.野生型；B.iRhom2UncvFig.1 Mammary glands whole mounts of iRhom2Uncv and WTNote: A. wild type；B. iRhom2Uncv

2.2 差異基因的表達分析

計算FPKM的大小衡量基因表達水平的高低，用Cuffdiff軟件分析差異表達情況，以表達差異倍數[log2(Fold Change)] >1，P<0.05作為篩選條件。iRhom2Uncv小鼠和野生型小鼠乳腺組織共得到725個差異表達的基因，476個基因表達下調，249個基因表達上調。以多重假設檢驗校正后的P值(padj)小于0.05 [即-log10(padj)>1.3]作為差異顯著性標準，得到18個顯著性表達差異的基因，其中6個在 iRhom2Uncv小鼠中表達顯著上調(P<0.05)，12個在iRhom2Uncv小鼠中表達顯著下調(P<0.05)(圖2)。Prl3b1、Prl2b1、Prl8a9基因屬于催乳素家族，這3個基因在iRhom2Uncv小鼠中不表達，log2(Fold Change)分別為-12.02716、-11.47758 和-10.35361(表1)。Mfsd2a和Zfp281基因在iRhom2Uncv小鼠中表達量顯著下調(P<0.05), 此外還有6個基因在iRhom2Uncv小鼠中也不表達。在表達上調的基因中，5個基因在野生型小鼠中不表達，而在iRhom2Uncv小鼠中表達量增加，且Mouse ENCODE transcriptome data顯示Olfr365在睪丸中的FPKM為0.21，在其他組織中不表達。

表1 差異基因列表Table 1 The list of different expression genes between iRhom2Uncv and WT

2.3 ELISA驗證

血清中的催乳素和雌激素檢測結果如圖3所示，iRhom2Uncv小鼠幾乎不產生催乳素，顯著低于野生型小鼠(P=0.006)，而雌激素水平高于野生型小鼠(P=0.037)。

圖3 野生型和iRhom2Uncv小鼠血清中的催乳素和雌激素水平Fig.3 Expression level of prolactin and estrogen in the serum of WT and iRhom2Uncvmice

3 討論

Uncv小鼠是我單位培育出的一種BALB/c遺傳背景的突變小鼠[5-6]，該小鼠純合子表型之一為毛囊分化障礙。通過基因定位、基因組掃描和克隆測序鑒定未知Uncv突變基因為iRhom2, 命名為iRhom2Uncv [6]。iRhom2Uncv突變為缺失非移碼突變，缺失區域定位在iRhom2的N末端，長度為309 bp。缺失區域移碼區域編碼氨基酸在各物種間高度保守。過表達iRhom2轉基因小鼠與iRhom2Uncv交配后挽救iRhom2Uncv的毛囊分化障礙表型，證實導致iRhom2Uncv小鼠表型是由于iRhom2 N末端缺失引起[6]。另外，iRhom2 N末端對內質網的TNFα 轉化酶(TNFα-converting enzyme, TACE)成熟是必須的，iRhom2Uncv突變為功能喪失突變[6]。

進一步研究發現iRhom2Uncv雌鼠乳腺發育障礙，喪失泌乳功能，但其機制尚不明確。本研究通過轉錄組測序發現，在iRhom2Uncv小鼠中有3個催乳素家族的基因不表達，且血清中也幾乎檢測不到催乳素表達。催乳素可以通過內分泌和自分泌/旁分泌途徑影響乳腺上皮細胞的發育，可直接作用于乳腺上皮細胞，或者通過信號轉導與轉錄激活因子5b(Stat5b)的信號轉導和轉錄激活間接作用于黃體，進而通過信號轉導與轉錄激活因子5a(Stat5a)途徑影響乳腺發育[7]。

iRhom2 與TACE相結合，促進 TACE 離開內質網到高爾基體上進行加工成熟[8-9]。雙調蛋白是乳腺導管的延伸最重要的旁分泌介導者，TACE可在上皮細胞表面剪切Areg，激活基質細胞的表皮生長因子受體(EGFR)信號通路影響乳腺側枝形態發生。前期的研究結果顯示，野生型 iRhom2 能夠促進 TACE 的成熟，然而過表達iRhom2Uncv卻不能誘導TACE 的成熟。我們推測iRhom2Uncv小鼠乳腺發育障礙可能與不能誘導TACE 的成熟有關。

本研究通過比較iRhom2Uncv小鼠和野生型小鼠乳腺組織的轉錄組測序結果，共發現725個差異表達基因(P<0.05)，包括476個下調基因和249個上調基因，為了更好地控制假陽性率，我們以padj<0.05作為差異顯著的篩選條件，共篩選出18個差異顯著的基因，包括6個上調基因和12個下調基因，同時對這些基因進行了文獻調研和功能分析。在iRhom2Uncv小鼠中Zfp281基因顯著下調，Zfp281基因編碼的是鋅指蛋白281。鋅指蛋白沒有固定的結構和作用，一般在轉錄及轉錄后調控，蛋白折疊與裝配以及 DNA、RNA 識別等分子功能基礎上，參與調節胚胎發育、機體免疫及腫瘤形成、發展等過程[10]。目前可見一些鋅指蛋白與乳腺發育相關，如Zfp157、Zfp289和ZNF503。Zfp157是乳腺轉錄因子Stat 6的下游靶點，在外胚層中表達，青春期后，Zfp157主要在導管的基底上皮細胞和毛囊的皮脂腺中表達[10]。Zfp289可能是堿性螺旋環螺旋轉錄因子的顯性負調控因子(Id-1)誘導乳腺上皮細胞增殖的重要介質[11]。ZNF503是GATA結合蛋白3(GATA3)表達和轉錄活性的轉錄抑制因子，可誘導乳腺上皮細胞增殖和乳腺癌的發生[12]。但目前未發現Zfp281與乳腺發育相關的研究，但在胚胎干細胞中，Zfp281可與胚胎干細胞核心轉錄因子Nanog啟動區的位點結合直接激活Nanog的表達，并且Zfp281同時具有激活域和抑制域，對胚胎干細胞的增殖、更新和多能性的調控網絡中起著雙重作用[13]。我們推測iRhom2Uncv小鼠乳腺發育障礙可能與Zfp281下調有關。

此外，Zfp281可以調控X射線修復交叉互補分子2(XRCC2)和4(XRCC4)的轉錄激活，通過調控不同修復機制基因的表達參與DNA損傷修復[14]。骨髓細胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，c-Myc)誘導的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)依賴于Zfp281的表達，Zfp281的轉錄受SRY盒轉錄因子4(SRY-box transcription factor 4，SOX4)控制，SOX4在許多人類惡性腫瘤中表達，影響關鍵生長因子、發育途徑和癌癥進展。Zfp281的轉錄也受到miR34a通過p53依賴機制的抑制[14]。可見Zfp281在腫瘤中具有重要的生物學功能，iRhom2Uncv小鼠可能具有不同于野生型小鼠的腫瘤發生或發展表型。

Zfp281也是神經元分化的調控因子，在小鼠皮層神經元終末分化和維甲酸誘導的神經母細胞瘤(neuroblastoma，NB)細胞分化過程中，Zfp281的表達減少，而異位表達Zfp281，可以抑制小鼠皮層神經元和NB細胞的分化[15]。在iRhom2Uncv小鼠中Mfsd2a和Grm3顯著下調，Mfsd2a(主要促進因子超家族成員2a)是跨膜蛋白和鈉依賴性溶血磷脂酰膽堿轉運體，是血腦屏障形成和維持完整性的關鍵組成部分[16-18]。Grm3是編碼代謝型谷氨酸受體3的基因，谷氨酸是中樞神經系統中主要的興奮性神經遞質，可激活離子型和代謝型谷氨酸受體。谷氨酸能神經元是神經系統中最為重要的興奮性神經元，谷氨酸能神經介質參與了正常大腦功能的大部分方面[19-21]，在許多神經病理學條件下可能受到干擾。iRhom2Uncv小鼠中嗅覺受體365(Olfr365)和碳酸酐酶10(Car10)顯著上調，嗅覺受體與鼻子中的氣味分子相互作用，啟動神經反應，從而觸發嗅覺[22]。嗅覺受體通過7個跨膜結構與許多神經遞質和激素受體結合，識別氣味信號和G蛋白介導的轉導。Car10可能在分泌途徑中與神經突起形成復合物，促進神經突起的表面運輸[23]。催乳素參與運動對慢性應激性記憶鞏固障礙的保護調節[24]。這些差異表達的基因在神經系統中具有重要的作用，同時研究發現iRhom在果蠅中主要在神經組織表達。我們推測，iRhom2Uncv小鼠可能具有不同于野生型小鼠的神經發育表型，其是否能應用于腫瘤生物學或神經生物學動物模型的建立需要進一步研究。