肽聚糖對肉制品中產氣莢膜梭菌芽孢萌發率影響及預測

朱瑤迪，張佳燁，李苗云，趙莉君，趙改名，馬陽陽，任宏榮，王文濤

肽聚糖對肉制品中產氣莢膜梭菌芽孢萌發率影響及預測

朱瑤迪，張佳燁，李苗云※，趙莉君，趙改名，馬陽陽，任宏榮，王文濤

（河南農業大學食品科學與技術學院，鄭州 450000）

該研究利用產氣莢膜梭菌（，）營養體及其芽孢肽聚糖以芽孢萌發率、渾濁度OD600%、Ca2+-DPA%變化率等為指標比較不同肽聚糖對芽孢萌發的影響；并針對芽孢萌發率檢測耗時、費力等問題，提出一種基于近紅外光譜技術（near infrared spectroscopy, NIR）定量預測不同濃度肽聚糖誘導芽孢萌發率研究。首先原始光譜經不同方式預處理，獲得最佳方法為標準正態變換，然后使用主成分分析和遺傳-聯合區間偏最小二乘法進行光譜數據降維及特征變量篩選，分別對不同濃度肽聚糖誘導芽孢、OD600%、Ca2+-DPA%進行快速預測。結果表明：營養體肽聚糖可有效誘導芽孢萌發，而芽孢肽聚糖效果不明顯。利用GA-siPLS篩選芽孢萌發特征變量的最佳特征區間分別是[3, 9, 11, 14]、[1, 7, 12, 15]和[7, 8, 12, 17]，其預測集和RMSEP分別為0.872 6，0.861 1，0.884 1和0.769，0.218%，42.34%。研究結果表明，利用NIR結合GA-siPLS可定量預測肽聚糖誘導芽孢的萌發率，實現芽孢萌發的快速預測，為保證肉制品安全提供有效手段。

菌；近紅外光譜；肉；肽聚糖；芽孢萌發； GA-siPLS；

0 引 言

產氣莢膜菌（，）是一種廣泛存在于環境中的革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，可在空氣、土壤、水及人和動物腸道中發現[1]。其芽孢對高溫、高壓、干燥、輻射以及強酸強堿等條件均具有極強的抗逆性，使其能在食品殺菌過程中存活，很難被殺死，并可長時間保持休眠狀態[1]。然而其一旦萌發就可快速繁殖，且開始產生毒素，不僅可引起人急性腹部絞痛和腹瀉，而且造成脹袋及腐敗。因此，不但致病性強，而且給肉品產業帶來很大的經濟損失，被稱為美國第三大食源性致病菌，每年與食物中毒相關的經濟損失達3.43億美元[2]。“先萌發，后殺滅”是芽孢研究的熱點[3-4]，目前，通過添加萌發劑可使芽孢快速、高效萌發，同時失去抗逆性，便于使用常規方法殺滅，保證肉制品食用安全。

肽聚糖是由細菌代謝過程中自身分泌的物質，是其細胞壁的主要成分，可作為一系列宿主-微生物相互作用的信號，尤其是對芽孢萌發有促進作用[5]。然而不同肽聚糖的組成和功能有顯著差別，張津瑜等[6]通過紅外光譜鑒定發現枯草芽孢桿菌（，.）芽孢皮層肽聚糖與營養體細胞壁肽聚糖特征氨基酸種類和含量大不相同。Shah等[7]和著名芽孢萌發專家Setlow[8]在2008年均提出了肽聚糖可誘導.芽孢萌發的新途徑，并認為在nmol/L為單位濃度即可高效誘導芽孢萌發。目前，芽孢萌發率的檢測主要是利用常規的化學指標判斷如熱抗性損失平板計數、芽孢渾濁度（OD600）、芽孢折光性測定等化學方法，不僅耗時費力，而且檢測結果往往延遲于生產、銷售，因此尋找一種快速、無損的方法來預測肽聚糖對芽孢萌發的影響是非常迫切的。

近紅外光譜分析技術是一種通過光譜信息反映物質內部成分的物理測試技術，具有分析速度快、操作便捷、無損等優點[9]。已被廣泛用于食品[10]、農產品[11]、藥品[12]等的定性分類和定量分析。目前，在食源性致病菌檢測方面的應用也越來越廣泛，如陳全勝等[13]運用近紅外光譜技術結合反向傳播人工神經網絡（BP-ANN）可以快速識別雞肉中的假單胞菌；魏穎琪[14]運用近紅外光譜技術結合主成分分析（PCA）、判別分析（LDA）和偏最小二乘回歸（PLSR）方法預測稻谷中有害霉菌的數量；谷芳等[15]運用近紅外光譜技術結合PCA算法預測豬肉中菌落總數；Bai等[16]運用近紅外（NIR）光譜和支持向量機（SVM）鑒定大腸桿菌O157：H7，單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌三種常見的食源菌。這些研究表明，近紅外光譜技術可以實現對食源性致病菌的定性和定量預測且模型精度高；但是目前關于近紅外光譜技術預測肉制品中芽孢萌發率的內容鮮有報道。

本研究以芽孢為研究對象，利用不同濃度營養體及其芽孢皮層肽聚糖分別誘導其芽孢萌發，并通過芽孢熱抗性損失（）、渾濁度（OD600%）、2,6-吡啶二羧酸（Ca2+-DPA%）釋放率等指標進行比較。另外采用NIR結合GA-siPLS算法，對營養體肽聚糖誘導芽孢萌發率進行定量分析，不僅可以對肉制品安全實現在線實時檢測，而且為快速預測不同萌發劑對芽孢萌發效果提供有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

菌種：產氣莢膜梭菌C1芽孢是由河南農業大學肉品加工與安全重點實驗室自行提取并鑒定（主要是從真空包裝的鹽焗雞中自行分離培養所得）產氣莢膜梭菌芽孢及其營養體肽聚糖是由河南農業大學肉品加工與安全重點實驗室自行提取，并鑒定。

1.1.2 試劑與培養基

胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂（TSC）、液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）、0.1%無菌蛋白胨水（BP均購自青島高科技工業園海博生物科技有限公司；胰蛋白酶Trypsin（1∶250）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；溶菌酶Lysozyme from chicken white購自Sigma公司；三氯化忒、2,6-吡啶二羧酸（DPA）（購買自Sigma公司），其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢熱抗性（）測定

在80 ℃、10 min的熱處理通常被稱作芽孢熱抗性損失[17]。通過平板計數法確定芽孢萌發的數量。將107mg/mL芽孢樣品與無菌水中的肽聚糖在37 ℃下孵育10 min，然后進行濕熱處理，梯度稀釋后用TSC培養基在37℃厭氧培養24 h計數，通過公式（1）計算。

式中為芽孢熱抗性損失，total熱激前芽孢總數，lgCFU/mL，survival熱處理后殘存活菌數, lgCFU/mL。

1.2.2 芽孢渾濁度（OD600%）和折光性測定

參照孫靜等[18]的方法檢測，取200L芽孢懸浮液在600 nm下測定OD600%（見公式2）。測定前后將其搖勻，每隔20 min取芽孢懸浮液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，放置于相差顯微鏡下觀察其折光性。

式中OD600%是OD600變化率，D是OD600下降值；D是初始OD600值。

1.2.3 Ca2+-2,6-吡啶二羧酸釋放率（Ca2+-DPA%）測定

參考Alistair等[19-20]的方法，采用熒光法測量Ca2+-DPA%。將肽聚糖誘導處理過的芽孢在7 000×和4 ℃下離心10 min，并測定Ca2+-DPA上清液，于96孔板中加入100L芽孢懸液與100L的20mol/ L氯化鋱（III）六水合物（TbCl3.6H2O）混合，用1 mol/L乙酸調pH值至5.6，酶標儀（Molecular Devices）測定。在激發波長為270 nm，發射波長為545 nm處測定熒光值。未經肽聚糖誘導處理的芽孢作為陰性對照。將1 mL培養的芽孢煮沸60 min為芽孢中總Ca2+-DPA量，Ca2+-DPA%通過公式（3）計算。

式中Ca2+-DPA%是初始Ca2+-DPA的百分比，F是芽孢釋放Ca2+-DPA量，F是初始Ca2+-DPA量。

1.2.4 營養體及其芽孢肽聚糖的提取

肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分，關于產氣莢膜梭菌營養體及其芽孢肽聚糖具體提取方法如下：首先將及其芽孢擴大培養后，利用超聲波物理破碎（條件：功率200 W，磁力50次超聲脈沖，每次5 s，間隔5 s），不溶性細胞壁組分再通過離心收集，并采用4%SDS重新懸浮，煮沸15 min，再采用熱無菌水（60℃）清洗數次直至除去殘留的SDS，進一步采用0.5 mg/mL的胰蛋白酶處理（10 mmol/L Tri-Hcl，pH值8），并加入10 mmol/L CaCl2，酶解16 h以除去共價結合的蛋白質，將酶解液加入SDS（終濃度1%）煮沸鈍化胰蛋白酶，并清洗除去SDS。將細胞壁重新懸浮于氫氟酸（5 mg細胞壁懸浮于2 mL 48% HF）中，4 ℃處理48 h。HF可以除去肽聚糖上磷酸二酯鍵共價連接的次生細胞壁多糖，包括磷壁酸、poly-（，GlcNAc）等。細胞壁組分再分別采用8 mol/L LiCl和0.1METDA清洗，無菌水清洗2次，最后采用丙酮除去脂磷壁酸和脂多糖。將樣品凍干，得到肽聚糖。并所得樣品進行純化，具體參照文獻[17]：將凍干后的肽聚糖在磷酸鹽緩沖液懸浮，加入變溶菌素酶解生成胞壁肽，同時利用硼氫化鈉還原后采用HPLC分離，ODS色譜柱，胞壁肽組分檢測采用紫外檢測器，波長206 nm，最后在檢測器出口單峰收集胞壁肽組分，并利用HPLC法脫鹽，凍干得到胞壁肽組分。

1.3 近紅外光譜采集和預處理

1.3.1 近紅外光譜數據采集

為保證儀器穩定性，先打開近紅外光譜儀預熱30 min，然后將樣品裝入液體樣品池中，設置掃描參數：儀器分辨率8 cm-1，掃描次數32次，光譜范圍為波數4 000～10 000 cm-1，每個樣品10 min/次，跟蹤采集60 min，獲得6條光譜，取平均；數據采集過程中，室內濕度基本保持不變，溫度控制在（20±5）℃。采集光譜時，每個濃度35個樣品，3個濃度共105條光譜，將預處理的光譜和實測值隨機劃分為訓練集70和預測集35個樣本，進行建模分析。

1.3.2 近紅外光譜數據預處理

由于外界因素（如基線漂移，光的散射以及環境等）會對光譜產生影響，需采用一定的預處理方法進行消除[21]，常采用的方法包括標準歸一化（standard normal variable，SNV）、多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）、中心化（Centralization）等。本研究對采集得到的105條光譜進行預處理，然后利用指標與偏最小二乘（PLS）建立預測模型，依據模型相關系數（）和交互驗證均方根誤差（RMSECV）等指標選擇最佳預處理方法，經比較，采用SNV對光譜進行預處理效果最佳，結果如表1和圖1所示。

表1 不同預處理方法對S指標預測模型的結果分析

圖1 不同肽聚糖誘導芽孢萌發的原始光譜和預處理后光譜示意圖

1.4 建模方法及模型評價

本試驗嘗試采用遺傳算法（GA）-聯合區間偏最小二乘（si-PLS）篩選變量建立模型。先利用GA進行全光譜變量篩選，然后進一步將所選光譜劃分為10，11，12，...，20個子區間，并劃分不同子區間時分別聯合2、3、4個子區間建立預測模型。同時依據RMSECV，以及來選擇肽聚糖誘導芽孢萌發的最佳預測模型，值越接近1，RMSECV值越小，模型的精度越高，表明模型的預測性能越好[21]。

1.5 數據處理及分析

采用MATLAB2016b處理近紅外光譜數據，SPSS16.0對數據結果進行單因素方差分析，Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 產氣莢膜梭菌芽孢萌發的變化情況

2.1.1 芽孢熱抗性損失

肽聚糖誘導芽孢萌發時失去熱抗性[22]，結果如表2所示，隨著時間的增加，經10-1、10-3、10-5mg/mL不同濃度營養體肽聚糖誘導后芽孢值分別為95.28%、88.83%和83.69%，能顯著誘導芽孢萌發（＜0.05）；而芽孢皮層肽聚糖誘導后值分別為10.00%、9.85%和1.32%，對芽孢萌發基本無影響。結果表明，營養體肽聚糖可有效誘導芽孢萌發，且隨著濃度增加，誘導芽孢萌發率越大，最高能使95.28%的芽孢萌發，而皮層肽聚糖則對芽孢萌發無影響。

表2 不同濃度C. Perfringens營養體肽聚糖對產氣莢膜梭菌數量的影響

注：表中字母表示差異性顯著水平，其中A, B, C代表組間差異性，a, b, c代表組內差異性。

Note: The letters in the table represent significant levels of variability, where A, B, and C represent inter group variability, and a, b, and c represent intra group variability.

2.1.2 芽孢渾濁度OD600

芽孢萌發時折光性降低且導致芽孢懸浮液OD600值下降，芽孢完全萌發時OD600下降約60%[23]。OD600結果如圖2所示，經10-1、10-3、10-5mg/mL濃度的營養體肽聚糖孵育60 min后，芽孢萌發顯著（＜0.05），OD600%值分別為59.41%、8.88%、1.80%；而芽孢皮層肽聚糖則對芽孢萌發無顯著影響（＞0.05），OD600%僅有輕微下降，萌發不明顯。利用相差顯微鏡進行驗證發現，隨著時間的增加，芽孢皮層肽聚糖誘導的芽孢則始終為“光亮”，芽孢未萌發（圖2c），而營養體肽聚糖誘導的芽孢折光性降低，芽孢中心由“光亮”逐漸變“黑暗”（圖2d）。

注：圖c、d中從左至右依次為0、20、40、60 min 的結果分析。

Note: Fig. c, d are the result of 0、20、40、60 min, from left to right.

圖2 不同濃度肽聚糖OD600變化示意圖

Fig.2 Schematic diagram of change of OD600with different PGd concentrations

2.1.3 Ca2+-2,6-吡啶二羧酸DPA（Ca2+-DPA）釋放率

在芽孢萌發過程中Ca2+-DPA為芽孢的特有物質，Ca2+-DPA的釋放是芽孢萌發的關鍵步驟[22-25]。加入不同肽聚糖孵育60 min后，10-1、10-3、10-5mg/mL濃度的營養體肽聚糖中芽孢Ca2+-DPA%分別為58%、13%和10%，其中濃度為10-1mg/mL營養體肽聚糖誘導芽孢萌發效果最佳，而芽孢皮層肽聚糖誘導芽孢萌發時，Ca2+-DPA%分別為7%、6%、5%則表明芽孢無萌發。芽孢萌發過程中Ca2+-DPA釋放結果如圖3所示。

2.2 主成分分析

本試驗采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對數據進行分析，可將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合指標上，采用較少的特征信息對芽孢萌發率進行有效表征[26-27]。經PCA分析后，前3個主成分的貢獻率分別為93.26%、5.23%、1.21%，累計貢獻率達到99.7%，營養體肽聚糖誘導芽孢萌發，可將不同濃度營養體肽聚糖誘導萌發芽孢區分開，部分存在交叉，還需進一步模式識別。

2.3 遺傳算法-聯合區間間隔偏最小二乘法（GA-siPLS）定量預測模型的建立

GA作為一種有效的全局搜索算法，可用于波長選擇優化[28-30]。GA變量篩選結果如表3所示，對于指標，利用GA-siPLS預測模型，當特征光譜劃分為20個區間，聯合區間數為4時，主成分數為4，光譜區間為[3, 9, 11, 14]，其訓練集的R和RMSEC分別為0.892 4和0.711，預測集R和RMSEP分別為0.8726和0.769。對于OD600%，當聯合區間數為4，主成分數為10時，光譜區間為[1, 7, 12, 15]時，獲得的模型最佳，其訓練集的R和RMSEC分別為0.896 3和0.189%，預測集的R和RMSEP分別為0.8611和0.218%。對Ca2+-DPA%，當聯合光譜區間為[7, 8, 12, 17]時，主成分因子數為6時，其訓練集的R和RMSEC分別為0.9037和39.53%，其預測集的R和RMSEP分別為0.884 1和42.34%。該模型在所有模型中精度最高，預測性能最佳。經驗證集進行模型驗證，結果如表3所示。不同指標預測集散點圖如圖4所示。

表3 芽孢萌發指標S、OD600%值和Ca2+-DPA%的GA-siPLS 預測結果

圖4 最佳營養體肽聚糖濃度條件下對芽孢S，OD600%值和Ca2+-DPA%預測集的散點圖

3 結論與討論

本研究首先探究了不同肽聚糖對芽孢萌發的影響，確定了營養體肽聚糖可有效誘導其芽孢萌發，這表明雖同是肽聚糖，但在芽孢形成過程中，肽聚糖結構應發生了變化，結構決定功能，芽孢皮層肽聚糖不能與萌發受體結合，從而無法誘導芽孢萌發，這與之前的研究一致，關于兩者之間的結構差異需要進一步研究。然后本研究利用、OD600%和Ca2+-DPA%等指標比較了不同濃度營養體肽聚糖對芽孢萌發效果，結果表明在10-1mg/mL時誘導芽孢萌發效果最佳。同時利用NIR技術結合GA-siPLS模型定量預測了不同濃度肽聚糖對芽孢萌發率，結果為：對于指標、OD600%和Ca2+-DPA%訓練集模型的相關系數R分別為0.892 4，0.896 3, 0.903 7；RMSEC分別為0.711，0.189%，39.53%；預測集模型的相關系數R分別為0.872 6，0.861 1和0.884 1；RMSEP分別為0.769，0.218%和42.34%，驗證集R分別為0.864 2，0.821 7和0.895 3，RMSECV分別為0.734，0.206%和41.27%，且利用Ca2+-DPA%指標，預測精度最高，可有效預測芽孢萌發率。綜上所述，利用近紅外光譜技術結合化學計量學方法預測食源性致病菌芽孢萌發率是可行的，為保證肉制品的食用安全性提供了理論依據和新的技術手段。

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Effect of different Peptidoglycan onspore germination and quantitative prediction

Zhu Yaodi, Zhang Jiaye, Li Miaoyun※, Zhao Lijun, Zhao Gaiming, Ma Yangyang, Ren Hongrong, Wang Wentao

(,,450000,)

() is a Gram-positive, anaerobic, spore forming pathogenic bacterium causing gastrointestinal (GI) diseases in humans and animals. The most important type that causes-associated food poisoning (FP) in humans istype A, and this illness is the third most commonly reported food-borne disease in the United States.spores are resistant to many environmental stresses and remain dormant in the environment for a long period of time. Once conditions are favorable, they can break their dormancy and initiate germination in response to a variety of compounds. Bacterial shape and cellular resistance to cytoplasmic turgor pressure are determined by peptidoglycan (PG), a polymer of repeated subunits of an N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetylmuramic acid (MurNAc) peptide monomer that surrounds the cytoplasmic membrane. PG can be targeted to a single germination receptor to efficiently inducespore germination. In this study,vegetative and its spore cortex peptidoglycan were used for spore germination rate (), turbidity (OD600%) and the release rate of Ca2+-DPA%. Among the existing spectroscopic methods, near-infrared spectroscopy (NIR) has been proven to be one of the most powerful tools for the qualitative and quantitative analysis of constituents in food, agricultural, wood and pharmaceutical products. The, and (OD600%) and Ca2+-DPA% were compared the effect of different peptidoglycans on spore germination, and the time-consuming and laborious shortage of spore germination rate detection, a study based on NIR combined with chemometric methods to quantitatively predict spore germination rates under different PG concentration conditions. Three preprocessed method, including MSC, SNV and centralization, were used to preprocess the original spectral. The optimal preprocessing method is SNV, and then using principal component analysis (PCA) and GA-joint interval Partial least squares (GA-siPLS) for spectral data dimensionality reduction and feature variable screening, and finally using GA-siPLS was used to rapidly predict spore, OD600%, and Ca2+-DPA% in different concentrations of PG. The results showed thatPG could effectively induce spore germination, and the best effect was induced by 10-1mg/mL. The results of were showed that thewas 95.28%, the OD600% was 29.41%, and the Ca2+-DPA release rate was 58%, while the spore PG effect was not obvious. Using GA-siPLS to screen for spore germination characteristic variables, the optimal feature intervals for, OD600%, and Ca2+-DPA% were[3, 9, 11, 14], [1, 7, 12, 15], and [7, 8, 12, 17], respectively. For the, the correlation coefficientsof the calibration set and prediction set are 0.892 4 and 0.872 6, respectively, and the root mean square error are 0.711 and 0.769 respectively. For the OD600%, the R are 0.896 3 and 0.861 1, respectively. The root mean square error are 0.189% and 0.218% respectively. For Ca2+-DPA%, the Rof the most training set and prediction set are 0.9037 and 0.884 1, respectively, and the root mean square error is 39.53% and 42.34%. The results show that the NIR combined with chemometric methods can quickly predict the spore germination rate of. This study can rapidly predict the spore germination rate, which can provide an effective means to ensure the safety of meat products.

bacteria; near-infrared spectroscopy; meat product; Peptidoglycan; spore germination; GA-siPLS;

朱瑤迪，張佳燁，李苗云，趙莉君，趙改名，馬陽陽，任宏榮，王文濤. 肽聚糖對肉制品中產氣莢膜梭菌芽孢萌發率影響及預測[J]. 農業工程學報，2020，36(4)：287－293. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.034 http://www.tcsae.org

Zhu Yaodi, Zhang Jiaye, Li Miaoyun, Zhao Lijun, Zhao Gaiming, Ma Yangyang, Ren Hongrong, Wang Wentao. Effect of different Peptidoglycan onspore germination and quantitative prediction[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 287－293. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.034 http://www.tcsae.org

2019-10-22

2020-01-07

國家自然科學基金項目（31571856）；省高校創新人才計劃（18HASTIT036）；河南省科技攻關項目（192102110216）；研究生教育改革與質量提升（19JG0703）；國家現代農業（肉牛/牦牛）產業技術體系專項（CARS-37）

朱瑤迪，講師，博士，主要從事肉品加工與安全控制研究。Email：zhu_yaodi@163.com

李苗云，博士，教授，博士生導師，主要從事為肉品加工與安全控制研究。Email：limy7476@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.034

TS251.5

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1002-6819(2020)-04-0287-07