一種絹紡原料除油微生物菌株的獲得及除油性能研究

陳祥平 程明丹 方佳 李喬蘭 肖露

摘要： 從繭絲腐化液中篩選獲得了一株脫油效率較高的菌株，經16S rDNA分子鑒定，命名為Enterobacter sp. TY4。對脫油菌株脫油條件進行了優化，獲得了最適碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨，最適C/N為0.25︰1，培養基最適pH 7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。將脫油菌株TY4與一株脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5進行共培養，對比了脫膠菌和除油菌同時接種與次序接種對重油繭絲脫膠除油效率的影響。結果表明，采用共培養方式和次序接種明顯提高了脫膠脫油效率，殘油率和脫膠率分別達0.48%和24.1%。

關鍵詞： 重油繭絲;脫油;微生物群落;產氣腸桿菌;脫膠脫油菌共培

中圖分類號： TS195.2文獻標志碼： A文章編號： 10017003（2020）01001406

引用頁碼： 011103DOI： 10.3969/j.issn.10017003.2020.01.003

Study on the acquisition and deoiling performance of an oilremoving microbial

strain for raw materials of silk spinning

CHEN Xiangping1， CHENG Ming1， ZHENG Dan1， FANG Jia2， LI Qiaolan2， XIAO Lu2

Abstract： A bacterial strain with high deoiling efficiency was obtained from bave corrosive liquid， and was named Enterobacter sp. TY4 based on 16S rDNA molecular identification. The oilremoving conditions of TY4 were optimized， and the optimal carbon source， nitrogen source， C/N， pH， liquor ratio and inoculum size were sucrose， peptone， 0.25︰1， 7.0， 2︰125， and 1%， respectively. The oilremoving Enterobacter sp. TY4 and degumming Aeromonas sp. TJ5 were cocultured， and the effect of coinoculation and sequential inoculation of TY4 and TJ5 on oilremoving and degumming efficiencies was investigated. The results show that coculture and sequential inoculation greatly enhance the oilremoving and degumming efficiencies， with the rates of 0.48% and 24.1%， respectively.

Key words： heavy oil bave; deoiling; microbial community; enterobacter aerogenes; coculture of oilremoving and degumming bacteria

絹紡原料來自于絲綢工程剔除或產生的各類下繭、滯頭、廢絲、繅絲腳渣等。這些下腳原料含有程度不同且差異較大的絲膠、油脂、污染物和雜質，必須通過精煉整理去除油脂、大部分絲膠、蠟質等。除油問題（尤其是重油繭絲）一直都是絹綿制備的主要難題之一，目前常用的除油方法主要是化學法和生物法兩種[13]。化學法主要包括利用有機溶劑除油、酸法除油及皂堿法除油等，但除油效果不理想，且污染環境。生物法（主要指腐化法）是一種傳統的絹紡原料除油方法，屬自然發酵法。它利用腐化液中多種微生物并存的混菌發酵體系，依靠微生物代謝分泌的酶達到除油的目的。該方法除油效果顯著，但由于是混菌發酵，微生物培育條件及脫油過程控制困難，產品質量不穩定，而且生產周期長，勞動強度大，生產環境氣味惡劣[47]。因此，篩選具有高效除油功能的微生物，將其應用于絹紡原料脫油處理，對于進一步改善精煉工藝、提高脫油效率、穩定產品品質具有重要意義。近年來，已有研究者分離篩選到高效脫油菌株，并利用脫油菌株或者產生的酶進行脫油，取得了良好的效果[89]。本文從繭絲腐化液中篩選獲得了一株具有較高脫油效率的菌株，對其脫油條件進行了優化，并將其與脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5共培養[10]，探討其脫膠除油效果。

1材料與方法

1.1材料

重油繭絲及腐化液（四川省南充銀海絲綢有限公司）。

1.2試劑和儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司），2×PCR Master Mix、瓊脂糖（北京天根生化科技有限公司），其余試劑均為國產分析純。

BioRad S1000 PCR儀、GEL Doc+凝膠成像儀、OLYMPUS BH2光學顯微鏡（美國BioRad公司），NU6382E超低溫冰箱（美國天美公司），DHP9082電熱恒溫培養箱（上海一恒實驗儀器有限公司），CS501恒溫培養搖床（上海富瑪實驗設備有限公司）。

1.3微生物及培養基

1）脫膠菌Aeromonas sp. TJ-5：從繭絲腐化液中篩選獲得，經16S rDNA鑒定，保藏于中國典型培養物保藏中心[10]。

2）牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3g/L;蛋白胨10g/L;NaCl 5g/L;pH 7.0;121℃滅菌20min。

3）選擇培養基：硝酸銨1g/L;磷酸二氫鉀0.5g/L;磷酸氫二鈉1.5g/L;氯化鈉1g/L;七水硫酸鎂02g/L;三丁酸甘油酯5mL;121℃滅菌20min。

4）種子培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。

5）脫油基礎培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。

6）脫油脫膠共同培養基：蛋白胨20g/L;蔗糖25g/L;NaCl 5g/L;SDS 0.5g/L;pH 7.0;蔗糖于112℃滅菌15min;其余121℃滅菌20min，然后無菌操作下混合。

Study on the acquisition and deoiling performance of an oilremoving microbial strain for raw materials of silk spinning一種絹紡原料除油微生物菌株的獲得及除油性能研究1.4方法

1.4.1脫油微生物的篩選

取100mL繭絲腐化液，離心（1000r/min，4℃）10min，收集上清液。上清液離心（10000r/min，4℃）10min后收集沉淀，沉淀用磷酸緩沖液（PBS，pH 8.0）離心（10000r/min，4℃）洗滌沉淀3次，將沉淀重懸于相同的PBS緩沖液中。取重懸液10mL加入牛肉膏蛋白胨培養基中富集培養12h。

初篩：取1mL富集培養液，經梯度稀釋，均勻涂布于以三丁酸甘油酯為唯一碳源的選擇培養基固體平板上，置于37℃培養箱中培養48h。根據菌落周圍的透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比（D/d），挑選比值較大的菌株進行下一步篩選[10]。

復篩：挑取初篩獲得的菌株，接種至種子培養基中，于30℃培養箱中培養12h，作為活化的種子培養液。以1%的接種量將培養好的種子液接種至脫油基礎培養基中，加入2g未脫油繭絲樣品，置于30℃搖床中培養48h。脫油完成后，測定殘油率。

1.4.2菌株16S-rDNA鑒定

離心收集培養至對數生長后期的菌體，采用細菌基因組DNA試劑盒提取菌株總DNA。采用細菌通用引物27f（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）和1492r（5TACGGCTAC CTTGTTACGACTT3）對總DNA進行PCR擴增，PCR擴增條件如下：變性94℃，1min，退火52℃，1min，延伸72℃，2min，循環30次[11]。擴增產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，將測序得到的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數據庫做相似性分析。

1.4.3菌株脫油條件的優化

分別考察了培養基碳源、氮源、C/N比、培養基pH值、接種量及裝液量對脫油效果的影響。以1%的接種量接種菌株TY10至脫油基礎培養基中，并加入2g繭絲樣品，置于30℃搖床150r/min培養48h，測定繭絲殘油率，分別考察不同的培養基及脫油條件對菌株脫油效果的影響。

1.4.4脫油菌與脫膠菌共培養對繭絲脫膠除油效果的影響

分別取在種子培養基中培養12h的脫膠菌TJ-5和脫油菌TY-4種子液，以1%的接種量接種至優化后的脫油培養基中，加入2g含油率為14%的重油繭絲樣品中，并置于30℃搖床內培養48h。分別測定繭絲處理后的殘油率及脫膠率。

1.4.5殘油率的測定

將脫膠脫油處理后的繭絲取出，用水洗凈，晾干后用濾紙包裹，放在索式抽提器中。加入75～100mL乙醚到150mL圓底燒瓶中，在恒溫水浴中保持圓底燒瓶43℃溫度，將冷凝管從索式抽提器的上端插入，通入冷凝水。回流后，取出樣品，等待乙醚完全揮發，放入烘箱，在105℃烘3h，取出放入干燥器中，冷卻至室溫稱重，即得脫油后樣品的干重。提取的油和圓底燒瓶放入烘箱中3h后取出。在干燥器內冷卻至室溫后稱重，減去球形瓶重即為油脂的質量[12]。

殘油率的計算公式：殘油率/%=燒瓶變化質量/（燒瓶變化質量+繭絲脫油后干重）×100。

1.4.6脫膠率的測定

取出脫膠脫油處理后的繭絲，沖洗、烘干;按照1.4.5的步驟將繭絲中剩余的油脂提取干凈，取出繭絲，烘干，恒重。在燒杯中加入6g/L的碳酸氫鈉溶液，同時加入恒重后的繭絲，在100℃條件下脫膠30min，期間不斷攪拌，反應結束后取出，先用溫水，再用冷水沖洗繭絲。重復上述步驟一次，將繭絲烘干后恒重，計算殘膠率。根據脫膠處理前后損失的質量計算脫膠效率[13]。

2結果與分析

2.1脫油功能菌的篩選鑒定

以繭絲腐化液為研究對象，利用三丁酸甘油酯為唯一碳源，篩選脫油功能微生物。通過測定透明圈大小，選取透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株，共計200余株，從中篩選20株進行進一步脫油實驗（表1），其中菌株TY-4脫油效果最好，繭絲殘油率達到0.71%，因此選擇TY4進行后續實驗。

菌株TY-4經活化后，提取基因組DNA，擴增獲得其16S-rDNA核酸序列，將該序列與NCBI中的DNA序列進行比對，構建菌株系統發育樹（圖1），菌株TY4與Enterobacter aerogenes EA1509E屬于同一分支，確定該菌株為產氣腸桿菌（Enterobacter），命名為Enterobacter sp. TY-4。

2.2菌株TY-4脫油條件的優化

2.2.1培養基對脫油效果的影響

實驗考察了培養基碳源、氮源和C/N對脫油效果的影響，如圖2所示。圖2（a）共選擇了果糖、可溶性淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖5種碳源，TY4菌株對繭絲的脫油率與碳源的種類有很大關系。當葡萄糖為碳源時，脫油效果最差，說明速效碳源雖然比較容易利用，但是卻不利于油脂的脫除。蔗糖作為碳源時，其殘油率最低，為0.58%。同時，蔗糖價格便宜，來源廣泛。因此，選擇蔗糖作為碳源進行后續實驗。

圖2（b）分別使用蛋白胨、酵母膏、氯化銨、硝酸鈉、尿素作為基本培養基的氮源，繭絲的殘油率有較大差異，硝酸鈉、氯化銨和尿素作為氮源時殘油率較高，而蛋白胨和酵母膏作為氮源時殘油率較低，說明菌株利用有機氮源脫油效果較好，這與郭磊[9]的研究結果一致。因此，選擇蛋白胨作為氮源進行后續實驗。

從圖2（c）可以看出，繭絲的殘油率隨著碳氮比的增加先降低后增加，碳氮比在0.25︰1時殘油率最低（0.49%）。因此，選擇0.25︰1作為最適碳氮比。

2.2.2pH值對TY4脫油的影響

微生物的生長繁殖需要在合適的pH值條件下進行，本文考察了pH值對菌株脫油效率的影響，如圖3所示。從圖3（a）可以看出，隨著培養基pH值的增加，殘油率逐漸減小，在pH 9.0時殘油率最低，達到0.27%。從圖3（b）可以看出，在pH 7.0時菌體濃度最高，增加或者降低pH值細胞生物量顯著下降。因此，在堿性條件下，殘油率降低主要是由于繭絲里的蛹油會在堿性條件下發生水解，屬于化學除油過程。陳慧[14]研究了一株紅球菌屬細菌X8的脫油工藝，在pH7.0時除油效果最優，殘油率達到了126%。綜合考慮，本文選擇pH7.0為最適pH值。

2.2.3浴比和接種量對脫油的影響

浴比和接種量對菌株脫油效率的影響如圖4所示。從圖4（a）可以看出，殘油率隨著浴比的增加逐漸降低，而浴比為2︰125以后，殘油率又有所增加。浴比對菌株脫油的影響可能與溶氧等有關，浴比過小，由于2g繭絲在搖瓶中所占空間較大，培養液可能不能沒過繭絲，因此殘油率會比較高。選擇2︰125作為最佳的浴比，此時的殘油率為0.44%。從圖4（b）可以看出，當接種量為1%時，繭絲樣品的殘油率最小，為043%。因此，選擇最適接種量為1%。

綜上所述，通過對菌株TY4脫油條件進行優化，獲得了最適的脫油條件為：最適碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨、最適C/N為0.25︰1，培養基最適pH 7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。在最適培養條件下進行脫油，重油繭絲殘油率最低可達0.33%。

2.3脫膠菌和脫油菌共培養對繭絲脫膠除油的影響

為了進一步考察功能微生物在絹紡原料精煉工藝中的應用，將篩選獲得的脫油菌TY4與脫膠菌TJ5進行共培養，考察兩株菌共同作用對原料脫膠除油效率的影響。選用重油繭絲為研究對象，分別考察了菌株單獨培養和共培養對繭絲脫膠率和殘油率的影響，結果如圖5所示。未接種菌株，繭絲脫油脫膠效果很差;單獨接種菌株TY4或TJ5，繭絲或殘油率高，或脫膠率低，前者脫膠率為12.8%，后者殘油率為862%;共培養后，由于兩種菌株的共同作用脫膠率和殘油率都達較好水平，分別為22.53%和0.64%。因此，通過將脫油菌和脫膠菌共培養對含膠較高的重油繭絲進行脫膠除油能夠取得較好的效果。

為了更好地提高重油繭絲脫膠除油效率，考察了脫油菌株和脫膠菌株同時接種共培養48h（TY+TJ48）和順序接種（先接種TY4，發酵24h后，接種TJ5）再共培養24h（TYTJ24）兩種工藝對繭絲脫膠和除油效果的影響，其結果見圖6。從圖6可以看出，與同時接種相比，采用順序接種，殘油率從072%降至0.5%，但脫膠率從18.3%降至14.0%，主要原因是脫膠時間減少。因此，將順序接種后共培養時間增加至48h，殘油率和脫膠率分別達到048%和24.1%。

3結論

1）利用透明圈法從繭絲腐化液中篩選獲得了一株脫油效果較好的菌株TY4，通過16S rDNA測序對菌株進行了鑒定，確定該菌株為產氣腸桿菌（Enterobacter），命名為Enterobacter sp. TY4。

2）通過對脫油菌株的脫油條件優化，獲得了最適的碳源為蔗糖、最適氮源為蛋白胨、最適C/N為0.25︰1，培養基最適pH7.0，最適浴比和接種量分別為2︰125和1%。在最適培養條件下進行脫油，重油繭絲殘油率最低可達0.33%。

3）通過脫油菌株TY4與脫膠菌株Aeromonas sp. TJ5的共培養實驗及兩種菌株不同接種方式的對比，結果顯示共培養法對絹紡重油原料的脫膠和除油效果明顯好于菌株單獨作用，且次序接種更有利提高脫膠脫油效率，其最適共培養時間為48h，殘油率和脫膠率分別達0.48%和24.1%。本實驗為重油原料除油、脫膠、環保、精煉工藝研究奠定了基礎。

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收稿日期： 20190610; 修回日期： 20201127

基金項目： 四川省科技計劃項目（18ZDYF3037）

作者簡介： 陳祥平（1955），男，教授級高級工程師，主要從事繭絲綢紡織材料及工程技術研究。