牛結核γ-干擾素ELISPOT方法在奶牛結核病檢疫的應用

楊顯超 李凱航 陶田谷晟 趙洪進 楊德全 吳秀娟 盧軍 王建

（上海市動物疫病預防控制中心 201103）

眾所周知，牛結核病是一種慢性人畜共患病，傳染范圍廣和傳染力強，該病嚴重損害整個畜牧業，威脅到人類健康[1]。該傳染疾病非常重要的一個途徑就是通過乳制品感染人。酶聯免疫斑點試驗 （ELISPOT） 是一種細胞免疫學檢測方法，在單細胞水平上基于高通量檢測機體分泌的抗體或細胞因子，從而得出我們所需，它其實就是ELISA 檢測技術的外延[2]。因為ELISPOT 敏感性和特異性高，已被廣泛用于各種傳染病的檢測。本研究旨在通過細胞免疫學手段，通過課題前期建立的牛結核γ-干擾素ELISPOT 檢測平臺，為日后基于此類方法進行牛結核病的檢測和采取相應的防控措施，奠定科學的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

上海某區5 個奶牛場共有1687 頭奶牛，每年兩次檢疫使用頸部皮內變態反應 （SICT），出現陽性或可疑牛再對其及周圍接觸較為密切的牛只進行γ 干擾素ELISPOT 檢測，目的在于更好的凈化牛結核病。

1.2 主要試劑、設備

牛結核菌素購自某生物科技有限公司，試劑批號201008；牛γ-干擾素ELISPOT 檢測試劑盒購自上海欣博盛生物科技有限公司，批號 3119-4HPW-2。酶標讀數儀 Tecan Sunrise；酶聯斑點圖像自動分析儀 （CTL ImmunoSpot S6）。

1.3 牛結核變態反應試驗

奶牛結核病按照國家標準 （GB/T18645-2002），用牛型結核分枝桿菌PPD 皮內變態反應試驗進行奶牛結核病檢測。判定標準為局部炎性反應明顯，皮厚差≥4mm 判定為陽性牛；局部炎性反應不明顯，2mm≤皮厚差＜4mm 判定為可疑牛；無炎性反應，皮厚差＜2mm 判定為陰性牛[3]。

1.4 ELISPOT 方法檢測

1.4.1 牛外周血單核細胞的制備

奶牛尾靜脈無菌抽取至少3ml 肝素抗凝血，吸取2ml 血與滅菌生理鹽水 1：1 混合后，緩緩地加入含3ml 牛淋巴細胞分離液的離心管中，400g 離心20min。這時，外周血單核細胞聚集在云霧狀層中，吸取單核細胞層加入滅菌PBS 混勻后，200g 離心10min，重復以上步驟兩次。棄去上清，加入1640 培養基重懸，用細胞計數儀進行計數。

1.4.2 牛結核γ-干擾素ELISPOT 檢測

按試劑盒說明書進行操作。大致步驟為在96 孔濾膜板中每孔加入 100μl 2.5μg/ml 的牛 γ 干擾素抗體 MT17.1，4℃包被過夜。在包被的板中，一份樣品分 3 管加入 50μl 培養液、10μg/ml 的 禽 型 PPD、10μg/ml 的 牛 型 PPD。然 后 加 入50μl1.25×105細胞數的外周血單個核細胞懸液，置于 37℃、5%CO2培養箱培養 24h；取出棄培養上清，洗板 5 次，加入100μl牛 γ-干擾素檢測抗體 MT307-biotin （0.25μg/ml），室溫孵育2h；洗板 5 次，加入 100μl HRP，37℃孵育 1h；加入 100μl 底物，室溫避光顯色。加入純凈水終止反應，移除液體晾干；將96 孔板放入CTL ImmunoSpot S6 中，對實驗結果進行掃描計數和分析[4]。

1.5 ELISPOT 同步檢測牛結核病臨床樣品

用1.3 方法檢測上海某區5 個奶牛場的1687 頭奶牛，選取陽性、可疑牛及其周邊密切接觸的牛群228 頭，采集其全血樣品進行ELISPOT 檢測，具體參照1.4 和1.5 步驟進行。

2 實驗結果

2.1 變態反應檢測結果

一共對5 個奶牛場1687 頭奶牛進行頸部皮內變態反應（SICT），根據國家標準進行判定，共檢出牛結核病陽性牛13頭，陽性率為0.77%，陽性牛未表現出明顯的臨床癥狀；檢出結核病可疑牛36 頭，其余皆為陰性。

2.2 牛結核γ-干擾素ELISPOT 檢測結果

頸部皮內變態反應 （SICT） 全檢 1687 頭奶牛后，將陽性牛、可疑牛及其密切接觸牛228 頭牛進行γ 干擾素ELISPOT 檢測，出現15 例牛結核分枝桿菌陽性、213 例陰性。

2.3 兩種方法符合率的比較

對上海存欄為1687 頭奶牛進行頸部皮內變態反應（SICT），參見附表。共有 13 頭陽性奶牛，36 頭可疑牛檢出，其余均為陰性，陽性牛未表現明顯的臨床癥狀。抽取228 頭陽性牛、可疑牛及其密切接觸牛228 頭牛抗凝血進行牛結核γ-干擾素ELISPOT 檢測，結果牛型結核病陽性15 份，陰性213 份。說明牛結核PPD 皮內變態反應結合γ 干擾素ELISPOT 可以有效提高牛結核病檢疫的準確性，減少因單純使用頸部皮內變態反應 （SICT） 出現的假陰性現象。在變態反應可疑牛中，仍然檢出了2 份γ-干擾素ELISPOT 陽性牛，兩者陽性符合率93%，陰性符合率99%。

附表 ELISPOT 方法與PPD 的比較 (單位：頭)

3 討論

酶聯免疫斑點檢測技術 （ELISPOT） 是近些年發展起來的新技術，是一種基于檢測細胞因子的免疫學方法。該方法是將細胞培養與ELISA 技術結合起來新構建的一種檢測技術，是在單細胞培養水平上體外檢測特異性細胞因子。可以對細胞因子分泌量進行方便快速的定量檢測，目前已經是國際上一項主流的免疫學檢測技術。并且ELISPOT 檢測技術也在動物研究領域具有廣闊的應用前景[5]。

γ-干擾素ELISPOT 在結核病診斷上有很大意義，但在某些方面仍有一定的局限性。一是ELISPOT 檢測技術能檢測牛結核分枝桿菌，但其結果不能作為標準來直接判定是否為活動性結核病，且敏感性不是很高，因此在牛結核流行污染地區不能單獨用此方法來排除結核病的類型[6]。二是環境中的結核分枝桿菌能明顯影響ELISPOT 的結果，環境的暴露強度與該病的檢測有正相關性[7]。因此，運用該檢測方法作為單一判斷標準可能會對結果造成誤診，故需要針對不同地區和不同牛群調整監測策略。三是此方法需要分離機體的外周血淋巴細胞，這對實驗人員的操作水平提出要求。最后，由于ELISPOT 檢測的費用高，使其較難進行大范圍的推廣和應用。免疫學檢測技術的不斷發展，ELISPOT 在動物疫病診斷的領域的應用也會更加深入，我們相信該技術會逐漸成為結核病實驗室診斷的候選檢測技術。