基于網絡藥理學和分子對接技術探討自擬“清瘟湯”治療新型冠狀病毒肺炎的機制*

馬詩瑜，方 潔，卞曉嵐△，楊 銘，鄭 嵐，鄭 林

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海200023；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海200032；3.上海中醫藥大學附屬光華醫院，上海200003）

臨床實踐顯示，中醫藥及中西醫結合治療新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎，COVID-2019）成效明顯，在疫情防控中發揮了重要作用。武漢市首個以中醫治療為主的方艙醫院患者觀察數據顯示，與單純西醫治療相比，中西醫結合治療患者的臨床癥狀消失時間（5.15 d）少2 d，體溫恢復時間（2.64 d）少1.7 d，平均住院時間少2.2 d，CT影像好轉率高22%，臨床治愈率高33%，普通轉重癥比率低27.4%[1]。瑞金醫院中醫科自擬“清瘟湯”（QWT），主要由貫眾、大青葉、板藍根、金銀花、蒲公英、金蕎麥、藿香、黃芪、防風、白術、甘草11味中藥組方，發揮益氣固表、祛濕排毒功效，疫情前已在瑞金醫院感染科重癥監護室（ICU）使用，對病毒性肺炎患者療效良好。新冠肺炎中醫辨證為“濕毒疫”，主要病位在肺。根據《溫病條辨》《傷寒論》等醫學著作，結合實際辨證論治，目前QWT已在瑞金醫院援助的武漢同濟協和醫院（光谷院區）、孝感市中心醫院、隨州市中心醫院、武漢大學附屬中南醫院等使用，取得了較好的臨床效果。

網絡藥理學的研究策略主要是從系統性和整體性的特點來研究中藥復方的多成分、多靶點、多途徑的協同作用，從而闡明藥物作用機制[2-9]。分子對接技術是一種較成熟的發現新藥的技術手段，采用計算機輔助進行藥物設計，通過化學計量學模擬分子的作用力和結構，尋找小分子（或配體）與已知結構的大分子（或受體）活性位點的低能結合模式[9]。本研究中基于網絡藥理學技術和分子對接技術探討QWT對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的作用機制，為進一步合理控制疫情及使用中藥提供理論基礎?，F報道如下。

1 研究方法

1.1 疾病及相關基因信息數據庫建立

1.2QWT化學成分及作用靶點數據庫建立[4-8]

化學成分篩選：通過搜索5個開源的數據庫（TCMID，CHEMBL，TCMSP，HIT，STITCH），得到QWT的相關活性成分及作用靶標數據，并使用NCBI數據庫的Gene基因搜索功能對靶點信息進行標準化。使用了類藥性描述符（QED）對化合物的吸收、分布、代謝、排泄（ADME）性質進行篩選[4-8]，QED整合了8個重要的分子描述符，設定的化合物類藥性指數閾值為0.2，大于0.2的類藥性成分納入網絡藥理學分析。

表1SARS-CoV-2的相關基因

作用靶標篩選：按照公式（1）計算復方作用靶標GS，其中分子與分母分別表示靶標與k個以上活性成分具有相互作用概率的負對數及按升序排列的秩次，P值越小相對應的GS值越大，而P≥0.05時相應的GS值為0。按照二項分布理論以P（X≥k）表示靶點與k個以上活性成分具有相互作用的概率值[公式（2）]進行篩選，公式（2）中n是活性化合物總數，g是平均每個靶標相互作用的活性化合物數，k為當前靶標相互作用的活性化合物數。當靶標P≤0.05時，說明該靶標與k個活性成分相互作用是小概率事件，則該靶標可以認為是復方的主要作用靶標。最終得出GS得分不為0的基因，即主要作用靶標。

活性成分篩選：在GS值基礎上，進一步采用復方作用靶標得分的GS值[公式（3）]進行篩選，式中GS是活性化合物i的靶標基因得分，Ni是活性化合物i的靶標基因數，I是指示變量，活性化合物i的得分等于其相應靶標得分的均值。通過GS值，可最終發現與復方中有效成分作用最相關的靶點。

上述工作由中藥網絡藥理學分析系統完成，TCMNPAS（TCM networkpharmacologyanalysissystem）國家計算機軟著登記號：2019SR1127090。

1.3 生物靶標網絡模型構建和分析

采用String V11.0軟件構建QWT靶標的蛋白質相互作用（protein-protein interactoin）網絡，物種設置為“Homo Sapiens”，最低閾值設置中等置信度“Medium confidence”為0.4。使用Cytoscape 3.7.0軟件計算相應的拓撲參數值進行篩選，使用MCODE功能對PPI網絡進行模塊分析，設置K-core值需大于4。

1.4 生物功能分析

對靶標基因生物功能分析主要有3個層次，即基因本體（GO分析）、信號通路（pathway）及醫學主題詞（Mesh），采用超幾何分布模型P值，評估靶標基因是否與特定的基因本體、信號通路及主題詞顯著關聯，同時還有經過False Discovery Rate（FDR）法調整的P值，反映靶點群與基因本體、信號通路的關聯強度，以調整的P＜0.01為關聯最顯著。

基于網絡的QWT作用于疾病靶標相關性分析，使用最短路徑長度評估QWT作用靶標與疾病的相關性，以P值判斷；顯示復方靶標與疾病靶標的關聯程度，按P值顯著性排序關聯程度最高的GO術語、KEGG通路。

1.5 分子對接試驗方法[9]

從QWT的有效成分中，選取等級值（degree，等級值越高，說明其在網絡拓撲關系中作用越重要）最高的活性成分（27種），與SARS-CoV-2的3C類似蛋白酶（3CLpro，PDB ID：6Lu7）和天然人類血管緊張素轉換酶相關的羧肽酶（ACE2，PDB ID：1R42.）進行分子對接。從RCSB數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載相關蛋白的結構，從ChemicalBook數據庫（https：//www.chemicalbook.com/）下載化合物結構，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進行加氫、加電子、加ROOT等操作，完成后進行分子對接，其中蛋白結構的設置為剛性大分子。使用算法為Local Search Parameters，得到結果（蛋白結構）中每個蛋白結合能最低的兩組，使用Pymol軟件對得到的最佳結果（蛋白結構）進行繪圖。

確實，馱子對我們村里人是大方的。一般村里人去他那兒彈棉花，算錢的時候，只要有零頭他全會抹掉，哪怕是九塊頭的。比如，五十九塊，他就會說，五十塊好了。再比如，過年過節的，馱子也會給村里人送一些小枕頭啊，小坐墊啊。盡管這些東西不是太值錢，但我們嶺北人是懂得感恩的。我們嶺北人就用語言東傳傳西傳傳，把個馱子說得跟圣人下凡似的好。

2 結果

2.1QWT化學成分及作用靶點數據庫建立

共獲得QWT中活性成分172個及主要靶標480個，詳見表1。根據組成QWT的歸經信息，構建復方的中藥-歸經網絡及重要活性成分-靶標網絡。詳見圖1和圖2。

表1 QWT中各藥材活性成分與對應366個靶標成分數量（個）

圖1 QWT“中藥-歸經”網絡圖

圖1和圖2中每個節點的大小代表了其等級值（表示該節點和網絡中其他節點相連的路線條目，等級值越大代表該節點是連接其他節點的重要橋梁），顏色由冷到暖代表了中心度值（betweenness centrality），連線的粗細和顏色代表了Edge betweenness，所有的顏色和粗細都是越大越粗，越大越暖色。由圖1可見，等級值較大的依次為胃經、肺經、脾經，等級值分別為10，5，5，說明大多數中藥歸屬此三經。

對QWT中172個活性成分及480個主要靶標構建QWT活性成分-靶點網絡圖，共609個節點、2 556條邊，篩選其中等級值≥20的活性成分有27種，詳見表3；等級值≥30的靶標共有89個，詳見表4。繪制27種重要成分與靶點間的網絡圖（圖2）可知，與靶標相關的主要活性成分主要分為兩類，一類是清熱解毒藥中抗炎、抗菌、抗病毒的有效成分，另一類主要是扶正固表藥中提高免疫的氨基酸成分。

2.2QWT靶標干預的生物功能分析

將480個作用靶標進行通路及基因本體的富集分析。QWT與SARS-CoV-2在GO水平上顯示出共關聯性，在前400個主要關聯的GO分類中兩者共關聯占比達73.60%。在P＜0.01水平上，與兩者顯著共關聯的GO分類主要有4類作用：1）抗炎作用（積極調控發熱、干擾素γ產生的正向調節、IL-12產生的正向調節、IL-6產生的正向調節、細胞對腫瘤壞死因子的反應、I-κB激酶/NF-κB信號傳導、NIK/NF-κB信號）；2）免疫作用（α-βT細胞活化、B細胞活化參與免疫反應、免疫球蛋白的生成、白細胞參與免疫反應、淋巴細胞活化參與免疫反應、單核細胞趨化、巨噬細胞趨化性的正調控、T細胞活化的正調控）；3）血管生成作用（腎素-血管緊張素調節血容量、血管生成）；4）鈣離子通道作用（胞漿鈣離子濃度的正調控、鈣離子穩態、鈣離子轉運的正向調節、鈣離子進入的正調控）。其中鈣離子通道作用與血管生成作用之間互相作用，免疫調節作用與抗炎作用之間也相互關聯。

KEGG富集分析（圖3）顯示，在P＜0.01水平上，QWT靶標與132條信號通路顯著關聯，與SARSCoV-2關聯為36條，與兩者均有關聯為26條。在兩者均有關聯的26條通路中，KEGG通路富集結果中限定為人類疾病部分的通路，得到14條靶標富集的疾病通路，其中有12條通路與感染性疾病、肺部疾病及免疫疾病相關，包括瘧疾、阿米巴病、軍團菌病、單純皰疹病毒感染、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、百日咳、甲型流感、肺結核、類風濕關節炎、同種異體移植排斥。其他通路主要與抗炎及免疫相關，包括主要作用于腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、核轉錄因子（NF-κB）信號通路、TLR多蛋白復合體（Toll）樣受體信號通路、輔助T細胞17（Th17）細胞分化T細胞受體信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、NF-κB信號通路、NLR蛋白（NOD）樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、產生IgA的腸道免疫網絡。

表3 QWT中與靶標最相關的重要活性成分

表4 QWT中等級值較高的靶標

2.3QWT和SARS-CoV-2的生物PPI網絡分析

使用String在線平臺對QWT的作用靶標進行PPI網絡構建，PPI網絡包含419個蛋白質節點、21 519條邊。根據PPI結果進一步進行網絡分析和計算，選取等級值≥100的節點，主要包括CXCL8，CXCR4，CXCL12，APP，CXCL1，AGT，CXCL10，KNG1，POMC，CCR5，CCR2，CXCL2等200個靶點，對高等級值的靶點進一步進行PPI分析。Stirng功能富集分析結果中，設定統計指標為FDR＜1×10-6，在KEGG通路富集的結果中發現，高等級值蛋白主要影響的KEGG疾病通路與感染性疾病、肺部疾病、免疫疾病、心血管疾病相關，包括肺結核、人嗜T淋巴細胞病毒-I（HTLV-I）感染、乙型病毒性肝炎、百日咳、軍團菌病、沙門菌感染、擴張型心肌病、動脈粥樣硬化、類風濕關節炎、阿米巴病、甲型流感。主要影響的信號通路有NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、血管平滑肌收縮等。同時，對高等級值靶點的PPI網絡進一步使用網絡模塊功能分析（MCODE）進行模塊分析，共得到2個子網絡模塊。詳見圖4。其中模塊1的靶點主要與免疫系統（圖中所示紫色）、抗炎（TNF信號通路，圖中所示綠色；MAPK信號通路，圖中所示黃色；白細胞介素信號，圖中所示紅色）相關；模塊2的靶點主要與細胞轉錄（圖中所示紅色）和RNA聚合酶Ⅱ特異的DNA結合轉錄因子結合（圖中所示紫色）相關。

2.4 分子對接結果

QWT中主要的27種活性成分與3CLpro和ACE2的對接結果見表5。其中，每個蛋白對接最好的前5位化合物的對接結果見圖5。5種化合物均能與2種蛋白形成氫鍵，其中異鼠李素均能與2種蛋白形成5個氫鍵；槲皮素能與3C類形成5個氫鍵，與ACE2結合形成2個氫鍵；芹菜素能與3C類形成4個氫鍵，與ACE2結合形成3個氫鍵；熊果酸均能與2種蛋白形成2個氫鍵；羽扇豆酚均能與2種蛋白形成1個氫鍵。

表5 QWT中活性成分的分子對接結果

3 討論

本研究中對QWT的活性成分、歸經、靶標及生物功能均進行了分析，并通過分子對接技術對直接作用于SARS-CoV-2的2種蛋白進行了對接，希望為進一步抗SARS-CoV-2治療提供支持。

新冠肺炎屬中醫“疫”范疇，病因為感受疫癘之氣，主要為“濕毒”疫氣，病位在肺，但前期的許多研究發現[12]，多數患者有消化道癥狀。QWT主要作用于胃經、肺經、脾經，方中有10味中藥作用于胃經，有5味中藥作用于肺經和脾經。說明QWT對于改善脾胃癥狀有較好作用，同時作用于肺經，祛濕和胃，調節胃腸道功能，共同改善肺部癥狀。

網絡藥理學研究發現，QWT中最相關的活性成分是琥珀酸、香豆素、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、槲皮素、山柰酚、脯氨酸、賴氨酸、木犀草素、色氨酸、L-纈氨酸、膽堿、芹菜素、β-谷固醇、苯丙氨酸、丙氨酸、水楊酸、DL-纈氨酸、羽扇豆酚、腺苷、谷氨酸、熊果酸、大黃素、異鼠李素、黃豆苷元、檸檬酸、阿魏酸。其中主要為4類成分：1）黃酮/黃酮苷元等清熱解毒中藥中常見的有效成分，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、木犀草素、芹菜素、黃豆苷元；2）五環三萜類的抗炎有效成分，熊果酸、羽扇豆酚；3）有機酸類有效成分，阿魏酸、琥珀酸、水楊酸、檸檬酸；4）氨基酸類成分，如賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺等。山柰酚、槲皮素、木犀草素、芹菜素是經典的抗炎和抗菌有效成分，以上幾種成分目前在抗炎、抗病毒、抗腫瘤、心血管保護、免疫調節等研究中也被報道有一定作用。山柰酚和槲皮素均能降低人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細菌內毒素和白細胞介素（IL）-1β的刺激等的表達[13-14]。槲皮素對皰疹病毒感染機體后的增殖具有抑制作用，也可拮抗病毒誘導的細胞凋亡[15]。木犀草素[16-19]和芹菜素對抗病毒均有一定作用，芹菜素更是已有發明專利涉及其用于預防和/或治療中東呼吸道綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）感染的藥物組合物[19]。熊果酸作為經典的保肝有效成分，除了能抑制乙型肝炎病毒轉錄用于病毒性肝炎[20]外，對皰疹病毒也有作用[21]。黃豆苷元能有效抑制老年冠心病患者血清炎性因子水平（hs-CRP，IL-6，TNF-α），對冠狀動脈粥樣硬化具有抗炎作用[22]。大黃素作為常見蒽醌類成分，體內及體外試驗中均表現出了抗炎活性，與其阻滯低氧誘導因子-1α（HIF-1α）/NF-κB-COX-2信號通路相關[23]。氨基酸類的有效成分主要發揮調節免疫作用，提高患者的免疫功能。多種活性成分協同作用，對于患者的抗炎、抗病毒、保肝、增強免疫力等多方面提供治療支持。

圖2 QWT中重要活性成分-靶標網絡圖[3]

圖3 KEGG富集分析

圖4 高節點數PPI的MCODE模塊分析

圖5 分子對接結果[5]

QWT與SARS-CoV-2，在生物功能、KEGG通路作用中，以及PPI互作網絡中，最為相關的信號通路主要為：IL-6免疫反應、IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等，最相關的疾病聚集主要為百日咳、甲型流感、類風濕關節炎、瘧疾等。由于新冠肺炎目前沒有特效藥物，發病早期患者的外周血白細胞總數正?；驕p低，淋巴細胞計數減少，提示免疫功能改變，因此應用中藥調節免疫功能顯得尤為重要。在重癥肺炎中就有報道，對炎性因子的調控與預后具有相關性[24]，PCT，CRP，TNF-α，IL-6水平均能較好地預測病情進展及急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發生，提示QWT可能通過相關的炎癥通路來進一步避免炎性介質的進一步釋放。Toll樣受體和NOD樣受體均為與自身免疫疾病相關的受體[25]，QWT通過調節兩者的信號通路，可以影響自噬和抗炎，自噬可影響感染炎性疾病的緩解和炎癥性疾病的病理過程。此外，新冠肺炎患者可能出現心功能損害，QWT的靶標可能影響腎素-血管緊張素調節血容量、調節血液循環、對鈣離子通道中的胞漿鈣離子濃度起正調控等，說明QWT有潛在的心血管保護作用，可能在一定程度上減輕患者的心臟負擔，改善心功能。

在分子對接結果中發現了5種活性成分（異鼠李素、槲皮素、芹菜素、熊果酸、羽扇豆酚）均能與SARSCoV-2的S蛋白和人體內血管緊張素轉換酶Ⅱ（ACE2）蛋白結合并形成氫鍵，說明其有潛在的成藥性，可能需要進一步的藥效學驗證?，F階段的研究認為[26]，使用ACEI或者ARB類藥物可能是一把“雙刃劍”，而和中藥的配合使用，可能有“減毒增效”之功用。本研究中還發現，QWT與SARS-CoV-2最相關的5個靶標可作用于瘧疾和類風濕關節炎，提示中藥制劑與氯喹的聯合使用可能進一步改善新冠肺炎的治療。

綜上所述，本研究中采用網絡藥理學的技術手段和分子對接技術，對自擬QWT的活性成分、歸經和靶標進行了系統性研究，闡釋了其對SARS-CoV-2的分子水平作用機制，突出了中藥制劑多成分、多靶標對機體整體調控的特點，為該復方制劑治療新冠肺炎提供了理論支持。