正交試驗設(shè)計法優(yōu)選六高康顆粒水提工藝*

黃慶寶，黃詩瑩，，陳劍平，張尚斌，，謝靜靜，張劍勇△

（1.廣東省深圳市中醫(yī)院·深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳518033；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳518033）

痛風患者常合并有其他疾病，如高血壓、糖尿病、高脂血癥、肥胖等[1]。深圳市中醫(yī)院張劍勇教授根據(jù)多年風濕病臨證經(jīng)驗，在代謝綜合征（MS）的基礎(chǔ)上提出“痛風六高癥”學(xué)說，臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥（痛風）、高體質(zhì)量（肥胖）、高血壓（高血壓病）、高血糖（糖尿病）、高血脂（高脂血癥）等癥。六高康方具有泄?jié)崂麧瘛⑾e排毒、潤肺健脾、補益肝腎、標本兼治的功效，治療痛風療效明確且可改善其他代謝指標[2-3]。但本方在使用前需先進行煎煮，使用和攜帶都不方便。顆粒劑具有載藥量大、吸收快、穩(wěn)定性好、服用和攜帶方便等優(yōu)點[4]，可彌補湯劑的不足，故本研究擬將其開發(fā)成顆粒劑。查閱文獻[5-6]，君藥土茯苓中有效活性成分落新婦苷具有泄?jié)峤舛尽⑼ɡP(guān)節(jié)功效，與六高康方的治療功效相符。此外，干膏率可反映其他成分的溶出程度[7-8]。故本研究中選擇落新婦苷含量及干膏率作為評價指標，采用正交試驗法對該方的水提過程中加水倍數(shù)、煎煮時間、煎煮次數(shù)等影響因素進行考察，優(yōu)選出六高康方的水提工藝，為該院內(nèi)制劑的提取工藝優(yōu)化提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津公司，SIL-20A自動進樣器）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，40 kHz）；EP225SM-DR型電子分析天平（瑞士Pricisa公司，精度為十萬分之一）；GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2 試劑

土茯苓、百合、葛根、金錢草、玉米須、益母草、靈芝、炒決明子、山楂、炒牛蒡子、山慈菇、鉤藤、刺五加、郁金、菊花、柴胡、天麻、山茱萸，均購自深圳市華輝藥業(yè)有限公司，批號分別為190213，190117，180911，190120，190210，181211，181225，181208，190112，181125，190118，181203，190118，190215，190115，181209，180211，經(jīng)深圳市中醫(yī)院張尚斌主任中藥師鑒定為正品。落新婦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111798-201504，純度93.9%）；水為純化水，冰醋酸為分析純，甲醇為色譜純（默克公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 落新婦苷含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Sepax Bio-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（B）-0.1%冰醋酸（A），梯度洗脫（0～20min時28%B，20.01～23 min時28%→90%B，23.01～24 min時90%A→28%B，24～31 min時28%B）；流速：1.0mL/min；檢測波長：291nm；進樣量：5μL；柱溫：35℃。

2.1.2 溶液制備

樣品溶液：取處方量飲片，每份221 g，按L9（34）正交試驗法進行提取，趁熱濾過，濃縮，放冷至室溫，加水定容至500 mL，備用。

供試品溶液：精密量取樣品溶液1 mL，加甲醇定容至20 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液：取落新婦苷1.03 mg，精密稱定，加甲醇溶液溶解并定容至5 mL，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：稱取缺土茯苓的處方量，按樣品溶液提取方法制備樣品溶液，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，而陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線繪制：精密量取落新婦苷對照品溶液適量，加甲醇溶液逐級稀釋，分別制得質(zhì)量濃度為4.84，9.67，19.34，38.69，77.37，154.75 μg/mL的系列對照品溶液，分別量取5 mL，按擬訂色譜條件進樣測定，以落新婦苷峰面積（Y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=6 286.01X-14 572.7（r=0.999 4，n=6）。結(jié)果表明，落新婦苷質(zhì)量濃度在4.84～154.75 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。同時，以峰面積為噪音3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10）的進樣質(zhì)量濃度分別測得檢測限為0.12 μg/mL，定量限為0.34 μg/mL。

精密度試驗：精密量取同一落新婦苷對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，計算落新婦苷峰面積。結(jié)果落新婦苷峰面積的RSD為0.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取樣品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣分析，計算峰面積。結(jié)果落新婦苷峰面積的RSD為1.01%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密量取樣品溶液6份，每份1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，計算峰面積。結(jié)果落新婦苷的平均質(zhì)量濃度為54.0652μg/mL，RSD為1.55%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取質(zhì)量濃度為54.0652μg/mL的樣品溶液1 mL，平行9份，分別加入低、中、高3組不同含量的落新婦苷對照品，加入量與落新婦苷含量比例分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1，每組3份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，測定峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 落新婦苷加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.2 干膏率測定

精密量取2.1.2項下水提溶液50.00 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定質(zhì)量，計算出膏率。出膏率（%）=[（W×500）/50.00/221]×100%，其中常數(shù)221為處方藥材總質(zhì)量，W為50.00 mL濃縮液中固形物質(zhì)量。

2.3 正交試驗設(shè)計

因素與水平：查閱相關(guān)文獻及單因素試驗結(jié)果[7-8]，采用正交試驗設(shè)計法，以樣品溶液中落新婦苷含量和干膏率為評價指標，對影響提取工藝的加水倍數(shù)（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、提取時間（因素C）進行優(yōu)選，各因素水平表見表2。

表2 因素水平表

正交試驗結(jié)果：按L9（34）正交試驗表設(shè)計試驗，采用加權(quán)評分法分析試驗結(jié)果，設(shè)定落新婦苷的含量加權(quán)系數(shù)為0.6、干膏率的加權(quán)系數(shù)為0.4，綜合評分值=（干膏率/干膏率最大值×0.4+落新婦苷含量/落新婦苷含量最大值×0.6）×100，結(jié)果見表3和表4。由表3直觀分析可得，綜合各因素影響水平為B＞C＞A，提取條件以A3B3C3為佳。為了驗證直觀分析結(jié)果，對試驗數(shù)據(jù)進行了方差分析，方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對水提工藝中干膏率和落新婦苷含量的影響有顯著性差異。稱取處方量飲片，對A1B3C1和A3B3C32個工藝進行比較驗證試驗。由見表5可見，兩者正交試驗方差分析結(jié)果差異不大。故從節(jié)省溶劑及節(jié)省時間考慮，確定最佳提取工藝為A1B3C1，即煎煮3次，每次加8倍量水，每次煎煮45 min。

表3 正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

表5 優(yōu)選提取工藝比較驗證試驗結(jié)果

2.4 驗證試驗

為驗證所得組合工藝的可行性，進行了3批驗證試驗。取處方量，按優(yōu)選工藝進行提取，測定干膏率及落新婦苷含量。結(jié)果見表6。可見，驗證試驗綜合評分值的平均值為97.23，表明正交試驗優(yōu)選的條件穩(wěn)定可行，可作為六高康顆粒的提取工藝。

表6 工藝驗證試驗結(jié)果（n=3）

3 討論

本方由18味中藥材組方，根據(jù)前期藥理研究表明[9-14]，方中主要藥效活性成分為生物堿類、黃酮類及多糖類，以水溶性成分為主，考慮到各成分溶解性能和臨床療效，故選擇以水為溶劑煎煮提取。

傳統(tǒng)中藥復(fù)方組分復(fù)雜，研究采用多指標成分考察提取工藝[7-8]。臣藥中天麻有效活性成分天麻素、對羥基苯甲醇，臣藥鉤藤中有效活性成分鉤藤堿、異鉤藤堿，佐藥決明子中有效活性成分大黃酚、橙黃決明素，以上3種飲片中的有效活性成分含量較低，難以檢測。同時對佐藥葛根中有效活性成分葛根素進行測定，結(jié)果表明，與方中其他成分互相干擾，通過改變流速、調(diào)整流動相比例及更換不同流動相進行洗脫，結(jié)果在相同保留時間內(nèi)存在干擾，分離度低，均無顯著效果，不能選擇以上4種飲片中的有效活性成分作為提取工藝的指標成分[15-19]。落新婦苷屬黃酮苷類化合物，具有抗炎、免疫抑制、抑制排異反應(yīng)、保肝護腎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗水腫、抗菌、抗糖尿病等多種藥理活性，臨床上可用于治療痛風，其效果顯著，且不良反應(yīng)少[20]。試驗發(fā)現(xiàn)，君藥土茯苓中落新婦苷分離度好，紫外吸收強，出峰位置無干擾，保留時間相對適中，故最終選取落新婦苷含量作為水提工藝的評價指標。

參考文獻[7-8]與單因素試驗結(jié)果可見，加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)3個因素對該處方的提取效率影響較大。因方中多為全草類、根莖類飲片，飲片吸水較多，故設(shè)置加水倍數(shù)的參數(shù)較大。正交試驗結(jié)果顯示，優(yōu)選的3個影響因素均為極值，但只有提取次數(shù)具有顯著性。

綜上所述，該方法操作簡便，優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定性好、可靠性強，可為六高康顆粒進一步開發(fā)成中藥制劑提供重要參考。