丹參酮Ⅰ對人胃腺癌細胞SGC-7901 EIF2a和EIF3a基因表達的調(diào)控作用*

劉新華，劉愛東

（1.河北省唐山市遷西縣中醫(yī)院，河北 唐山064300；2.華北理工大學附屬醫(yī)院，河北 唐山063000）

丹參酮是從中藥材丹參及同屬植物內(nèi)分離的天然脂溶性產(chǎn)物，含丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等成分[1]。早期多關(guān)注丹參酮ⅡA的心血管保護效應及抗腫瘤效應[2]。丹參酮Ⅰ對小細胞肺癌、乳腺癌等細胞系均存在生長抑制作用[3-4]，同時可通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激促使前列腺癌細胞凋亡[5]，但是否對胃癌存在抗腫瘤作用尚未明確。真核翻譯起始因子（EIFs）為參與真核細胞翻譯起始過程的蛋白質(zhì)，在多種惡性腫瘤內(nèi)均可見EIF3多個亞基表達，參與癌細胞翻譯起始、細胞周期調(diào)控及增殖分化過程，被認為是預測腫瘤進展的分子標志物[6]。本研究中擬采用丹參酮Ⅰ體外干預胃腺癌細胞株SGC-7901，探討其對胃腺癌細胞增殖、凋亡及EIF2a和EIF3a表達影響，為胃腺癌發(fā)病機制及臨床診治的研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

儀器：UVP-GD8000型紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國California公司）；PCR熱循環(huán)儀（美國Thermo公司）；SmartSpec Plus型全自動紫外分光光度計（美國Bio-Rad公司）；電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）；DM5000B型顯微鏡（德國Leica公司）；WS2-162-79型恒溫水浴箱（丹麥Heto Holten公司）；FACsort型流式細胞儀（美國BD公司）；Synergy H4型酶標儀（美國Invitrogen公司）。

試劑：丹參酮Ⅰ化學標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為T101150，純度＞98%）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號為HCL5852）；胎牛血清（FBS，批號為HLC1401）、胰蛋白酶（批號為T105531），二甲基亞砜（DMSO，批號為D103278），均購自美國Sigma公司；Trizol抽提試劑盒（批號為15596018）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號為11939823001）購自美國Promega公司；AnnexinV細胞凋亡試劑盒（瑞士羅氏公司，批號為MA0220）；Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶PstⅠ、EcoRⅠ（批號為K1034）均購自日本TaKaRa公司；聚合酶聯(lián)反應（PCR）引物（日本TaKaRa公司設(shè)計及合成，批號為SC1568-2）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Promega公司，批號為M113503）；其余試劑均為分析純（國產(chǎn)）。

細胞：人胃腺癌細胞株SGC-7901（上海酶聯(lián)生物研究所）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)方法：人胃腺癌細胞株SGC-7901用含10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)及密閉傳代，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

丹參酮Ⅰ溶液保存：丹參酮Ⅰ溶于0.02%DMSO保存。

分組：取對數(shù)生長期人胃腺癌細胞株SGC-7901接種于孔板，加入含丹參酮Ⅰ培養(yǎng)基質(zhì)量濃度1，5，10 μg/mL，并設(shè)定不加入丹參酮Ⅰ孔板為空白對照。

RT-PCR測定EIF2a和EIF3α mRNA：收集培養(yǎng)板各孔SGC-7901細胞株，Trizol抽提試劑盒提取RNA，確定RNA完整、純度與濃度滿意后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行RT-PCR反應，反應總體系20 μL為2×SYBR Green PCR主混合物10 μL+DEPC水6 μL+上下游引物各1 μL+cDNA 2 μL，EIF2a上游引物序列為5′-ATCCCCATGGAACGACCTG-3′，下游為5′-ACCCGCCAGGGACAAAAATG-3′。EIF3a上游引物序列為5′-TAGATCAAAATGTCCTGGGCT-3′，下游為5′-TGGCAGACGATGTAACAACTT-3′；β-actin（內(nèi)參）上游引物序列為5′-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物為5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-3′。PCR反應條件為β-actin 94℃5 min，60℃45 s，72℃5 min，40個循環(huán)，長度190 bp；EIF2a 94℃5 min，60℃45 s，72℃5 min，40個循環(huán)，長度237 bp；EIF2a 94℃5 min，60℃45 s，72℃5 min，40個循環(huán)，長度236 bp。PCR反應完畢擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖，采用2-△△Ct法[7]計算基因表達量。

MTT比色法測定細胞增殖：取對數(shù)生長期生長良好的4組細胞，采用胰酶消化法收集細胞懸液于流式管內(nèi)，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，每組設(shè)4個復孔，24，48，72 h分別加入MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO，低速震蕩5～10 min，酶標儀于490 nm波長處測定吸光度（A）值。抑制率=（對照孔A值-試驗孔A值）/對照孔A值×100.0%[8]。

流式法測定細胞周期：取對數(shù)生長期生長良好的SGC-7901細胞株，丹參酮Ⅰ作用72 h后收集細胞，AnnexinV、Propidium Iodide（PI）雙染色，混合均勻，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm）測定細胞凋亡率及細胞周期分布[9]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1EIF2amRNA和EIF3a mRNA表達

丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度干預72 h后，SGC-7901細胞株EIF2a mRNA和EIF3a mRNA表達降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；EIF2a mRNA和EIF3a mRNA比較，丹參酮Ⅰ1 μg/mL＞5 μg/mL＞10 μg/mL（P＜0.05）。詳見圖1和圖2。

2.2 細胞增殖抑制情況

細胞培養(yǎng)24，48，72 h后，空白對照組A值上升，抑制率無變化，丹參酮Ⅰ1，5，10 μg/mL組細胞培養(yǎng)不同時間A值低于空白對照組（P＜0.05），抑制率高于空白對照組（P＜0.05）；不同時間A值比較，丹參酮Ⅰ1 μg/mL＞5 μg/mL＞10 μg/mL；不同時間抑制率比較，丹參酮Ⅰ，1 μg/mL＜5 μg/mL＜10 μg/mL（P＜0.05）。詳見圖3。

圖1 培養(yǎng)72h各組SGC-7901細胞株EIF2amRNA和EIF3amRNA比較

圖2 培養(yǎng)72h各組SGC-7901細胞株EIF2amRNA和EIF3amRNA

圖3 不同時間點各組A值和抑制率變化

2.3 細胞周期分布

丹參酮Ⅰ作用72 h后，阻滯于G1期細胞增多，S期細胞減少，呈明顯的濃度依賴性特點，丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度組G1期細胞比例高于空白對照組（P＜0.05），S期細胞比例低于空白對照組（P＜0.05）；G1期細胞比例丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度組對比，1 μg/mL＜5 μg/mL＜10 μg/mL；S期細胞比例丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度組對比，1 μg/mL＞5 μg/mL＞10 μg/mL（P＜0.05）。詳見表1。丹參酮Ⅰ1，5，10 μg/mL組細胞凋亡率分別為（27.00±2.77）%、（35.01±4.37）%、（42.17±3.57）%，均高于空白對照組的（2.21±1.22）%，丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度組細胞凋亡率比較，1 μg/mL＜5 μg/mL＜10 μg/mL（P＜0.05）。詳見圖4。

表1 不同質(zhì)量濃度丹參酮Ⅰ作用72 h SGC-7901細胞株細胞周期分布（±s，%）

表1 不同質(zhì)量濃度丹參酮Ⅰ作用72 h SGC-7901細胞株細胞周期分布（±s，%）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與丹參酮Ⅰ1 μg/mL組比較，#P＜0.05；與丹參酮Ⅰ5 μg/mL組比較，△P＜0.05。

組別丹參酮Ⅰ1 μg/mL 5 μg/mL 10 μg/mL空白對照組G1期57.02±1.77*60.02±3.74*#65.25±2.24*#△53.25±4.63 S期10.45±2.14*7.02±2.77*#3.06±0.78*#△12.63±2.76 G2期33.25±2.96 33.52±2.76 32.79±3.47 34.15±2.06

圖4 各組作用72 h細胞凋亡率情況

3 討論

腫瘤發(fā)生不僅與細胞增殖、分化受阻有關(guān)，同時與細胞凋亡通路抑制及細胞活性提升有關(guān)[10]，故明確誘導劑及藥物對癌細胞增殖凋亡的影響，抑制癌細胞增殖，有望指導腫瘤治療[11]。丹參為唇形科植物丹參干燥根及根莖，有抗菌消炎、活血化瘀之功效[12]。丹參酮Ⅰ是從丹參根部提取的脂溶性丹參酮類成分，屬二萜醌類衍生物，含菲醌結(jié)構(gòu)，可釋放自由基引起DNA損傷，抑制腫瘤細胞DNA合成。丹參酮類化合物可抑制人肝癌、乳腺癌細胞增殖[13]。體外試驗表明，丹參酮Ⅰ可抑制HepG2細胞增殖，阻滯細胞于G1期，誘導細胞凋亡[14]。

EIFs為一類真核細胞蛋白質(zhì)翻譯必需蛋白質(zhì)[15]，不僅參與翻譯起始過程，同時與生命活動反應有關(guān)，在核內(nèi)參與蛋白質(zhì)合成及細胞惡變過程[16]。EIF2和EIF3均為典型EIFs，其中EIF3為復雜、大翻譯起始EIFs，至少包含12個亞基，在翻譯起始形成復合物前可通過保證核糖體小亞基保持游離狀態(tài)，穩(wěn)定EIF2與Mer-tRNAi與鳥嘌呤-5′-三磷酸（GTP）形成三元復合物。EIF3a是EIF3最大亞基，定位于染色體10q26，EIF3a廣泛表達于所有組織，但表達程度存在組織差異，且EIF3a高表達對細胞增殖有明顯的促進作用。動物試驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腫瘤組織EIF3a表達較正常組織高，尤其宮頸癌、胃癌中[17-18]。WEI等[19]的研究指出，NIH3T3細胞EIF3a過度表達可誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化，而通過下調(diào)EIF3a水平可減少細胞克隆數(shù)目，延長細胞倍增時間。本研究結(jié)果顯示，丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度干預后胃腺癌細胞株SGC-7901 EIF3a mRNA降低，存在濃度依賴性特點，推測丹參酮Ⅰ可通過下調(diào)EIF3a表達抑制胃腺癌細胞增殖，考慮EIF3a過度表達可維持癌細胞惡性表型，選擇性提高致癌相關(guān)基因表達，促成癌細胞生長及癌變，而負調(diào)控EIF3a可抑制癌細胞分化及增殖。

EIF2a同樣為蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，調(diào)節(jié)折疊蛋白聚集。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細胞內(nèi)，是蛋白質(zhì)合成后折疊修飾的關(guān)鍵場所，EIF2a活性上升，可增加自身磷酸化水平，加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔。STUMPF等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丹參預處理可抑制肝細胞EIF2a磷酸化，降低EIF2a表達，抑制總體蛋白翻譯，最終引起細胞凋亡。對胃腺癌細胞株SGC-7901給予不同質(zhì)量濃度丹參酮Ⅰ干預，并設(shè)立空白對照，結(jié)果顯示，干預72 h丹參酮Ⅰ各質(zhì)量濃度組EIF2a mRNA水平降低，支撐丹參酮Ⅰ抑制EIF2a活性，降低其磷酸化水平的結(jié)論。丹參酮Ⅰ可通過拮抗氧自由基，保護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器，影響EIF2a亞基磷酸化修飾過程順利進行，抑制蛋白質(zhì)合成，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔，同時分解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯誤折疊蛋白，提供有利分子環(huán)境，逆轉(zhuǎn)細胞凋亡。WANG等[21]對丹參酮Ⅰ抗腫瘤細胞增殖的研究發(fā)現(xiàn)，人肺腺癌細胞株經(jīng)丹參酮Ⅰ處理后細胞增殖明顯得到抑制。本研究結(jié)果顯示，丹參酮Ⅰ不同質(zhì)量濃度組干預24，48，72 h，細胞增殖抑制率上升，且高劑量組上升更明顯，故推測丹參酮Ⅰ可誘導細胞良性分化，可抑制胃腺癌細胞增殖。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹參酮Ⅰ刺激后，胃腺癌細胞株G1期細胞數(shù)量增加，S期細胞減少，細胞凋亡率上升，考慮丹參酮Ⅰ對胃腺癌細胞增殖抑制作用與DNA合成抑制有關(guān)，可能通過抑制細胞增殖相關(guān)癌基因表達，阻斷細胞增殖周期，促進SGC-7901細胞凋亡，進而抑制細胞增殖。

細胞凋亡受多種基因調(diào)控，癌基因表達抑制、活性喪失等均可限制腫瘤細胞分化，而EIF2a和EIF3a可能存在原癌基因類似作用，丹參酮Ⅰ通過抑制該基因表達下調(diào)胃腺癌細胞株活性，并誘導癌細胞凋亡。故推測丹參酮Ⅰ存在抗腫瘤活性，可能通過影響腫瘤相關(guān)基因EIF2a和EIF3a表達而抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，有望作為胃腺癌治療研究的新靶點。