注射用重組人干擾素α-1b溶解后活性穩定性及霧化粒徑研究*

陶婉君，李 根，郭文玫

（電子科技大學醫學院附屬婦女兒童中心醫院·四川省成都市婦女兒童中心醫院，四川 成都610091）

干擾素具有廣譜抗病毒和免疫調節作用，臨床常用于治療病毒性疾病[1-2]。霧化吸入重組人干擾素ɑ-1b（rhIFN α-1b）已被國家標準處方集[3]和《兒童霧化中心規范化管理指南》[4]《重組人干擾素α-1b在兒科的臨床應用專家共識》[5]推薦使用，其對兒童病毒感染的治療有重要作用[6-7]。rhIFN α-1b藥品說明書上的適應證為用于治療病毒性疾病和某些惡性腫瘤。目前關于rhIFN α-1b超藥品說明書霧化的研究多為針對某病毒性疾病的療效、用藥劑量。為保證療效，需規范超藥品說明書用藥治療過程，增加用藥安全性。本研究中對注射用rhIFN α-1b霧化的粒徑和溶解后的活性穩定性進行了考察，為規范使用rhIFN α-1b霧化吸入療法提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Winner311XP型激光粒度儀（濟南微納顆粒儀器股份有限公司）；ZJ24型CO2培養箱（美國NBS公司）；XPS-1B型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；MD SpectraMax M3型酶標儀（美國分子儀器公司）；S型冷凝管；pHfe20-K型酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）；HYC-360型2～8℃冰箱（海爾集團）；SW-CJ-1F型凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；ML203型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為萬分之一）；NEC25S型空氣壓縮泵霧化器（歐姆龍健康醫療＜中國＞有限公司）；M102型網式霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）。

1.2 試藥

注射用rhIFN α-1b[深圳科興生物工程有限公司，批號為201802010，規格為每支20 μg，（20 μg相當于20萬IU）]；人羊膜成纖維細胞（WISH，上海細胞研究所）；水皰性口炎病毒（VSV）株（中國食品藥品檢定研究院）；胎牛血清（Immuno Probe），1640培養基（gibco）；消化液、染色液、脫色液均為自配；滅菌用注射用水（國藥集團容生制藥有限公司，批號為1711516）；氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號為7G97D2）。

2 方法與結果

2.1 注射用rhIFN α-1b溶解后活性穩定性

無菌條件下操作。取10支樣品，分別用1 mL滅菌注射用水和氯化鈉注射液溶解，混勻，分裝至小離心管，作為供試品溶液，分別在4℃及25℃溫度條件下存放0，1，6，12，24 h。取以上不同條件存放供試品溶液各1支，用測定培養液稀釋成105 IU/mL的溶液。在96孔細胞培養板中，每個稀釋度各2孔。

照2015年版《中國藥典（三部）》干擾素活性測定法測定。Wish/VSV微量病毒抑制法的具體操作步驟：在96孔培養板中，每孔加入3.5×105/mLWish細胞100μL，置含5%CO2的37℃恒溫培養箱培養5 h。待其生長成單層細胞后，棄上清液，于培養板內1次加入系列稀釋液（稀釋度為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，共8個稀釋度）的檢測，每孔100 μL，每個稀釋度各2孔。同時，設置8個稀釋度的rhIFN α-1b標準品作為對照，將含有rhIFN α-1b檢測樣品和標準品的培養板置含5%CO2的37℃恒溫箱中孵育20 h。棄上清液后，于rhIFN α-1b檢測樣品和標準品培養板孔內各分別加入100 CID5OVSV病毒株，再培養24 h。待標準品溶液的50%病變點在1 IU/mL時。棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入染色液50μL，室溫放置30min后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μL，室溫放置3～5 min，混勻，用酶標儀以630 nm為參比波長，在570nm波長處測定吸光度，記錄測定結果。

以滅菌注射用水為溶劑的供試品溶液，經4℃溫度條件下存放1，6，12，24 h后的生物學活性相當于0 h活性的96.76%～100.46%，生物活性未明顯下降，相對穩定；供試品溶液經25℃溫度條件下存放1，6，12，24 h后的生物學活性相當于0 h活性的91.24%～103.69%，生物活性有波動，但仍在合格范圍內。詳見表1。

表1rhIFN α-1b用不同溶劑溶解后的活性測定結果（×105IU/mL，平均值/2孔）

2.2 不同霧化器霧化注射用rhIFN α-1b的粒徑分布

分別選用歐姆龍NE-C25S型壓縮式霧化器和魚躍M102型網式霧化器。用5 mL注射用水充分溶解注射用rhIFN α-1b后，轉移至霧化器霧化壺內，霧化10～15 min。使用激光粒度儀檢測，并記錄藥液霧化后微粒的粒徑分布情況。

壓縮式霧化器霧化微粒粒徑分布：注射用rhIFN α-1b藥液霧化后微粒粒徑呈正態分布，詳見表2。藥液全部霧化后粒徑小于12 μm，超過80%的微粒粒徑分布于1～5 μm。試驗表明，rhIFN α-1b霧化后，藥液微粒可到達肺泡組織，又不易隨氣流呼出，可作用于肺部組織。

表2 壓縮式霧化器霧化粒徑分布

網式霧化器霧化微粒粒徑分布：注射用rhIFN α-1b藥液霧化后微粒粒徑呈正態分布，詳見表3。藥液全部霧化后粒徑小于12 μm，超過70%的微粒粒徑分布于1～5 μm區間。試驗表明，rhIFNα-1b霧化后，藥液微粒可到達肺泡組織，又不易隨氣流呼出，可作用于肺部組織。

表3 網式霧化器霧化粒徑分布表

3 討論

兒童霧化吸入治療可使藥物直接作用于氣道黏膜，具有靶向性強、療效高、安全性好、操作簡便、兒童順應性高等優點，并可經支氣管、細支氣管到達肺部，較多地集中在肺部組織，較肌肉注射給藥作用更持久[8]。臨床使用中，注射用rhIFN ɑ-1b常單用或聯合用藥，超說明書霧化用于治療毛細支氣管炎、病毒性肺炎、慢性支氣管炎、手足口病、皰疹性咽峽炎等疾病[9]。注射用rhINF ɑ-1b霧化治療疾病過程中，影響有效性和安全性的因素很多，如不同的霧化吸入裝置產生的氣溶膠顆粒大小不一，不同大小的氣溶膠顆粒霧化吸入時到達兒童氣道的部位不同，藥物溶解后的穩定性等[10-11]。

注射用rhIFN α-1b藥品說明書中的溶劑為滅菌注射用水，臨床霧化常選用滅菌注射用水或氯化鈉注射液作為溶劑。本研究結果顯示，選擇滅菌注射用水或氯化鈉注射液作為溶劑，注射用rhIFN α-1b溶解后的活性變化均在合格范圍內，提示注射用rhIFN α-1b在4℃或25℃保存24 h內穩定。

霧化吸入臨床應用廣泛，但吸入專用制劑品種少，臨床使用西藥注射液、中藥注射液、中草藥湯劑等進行霧化[12-13]。但這些藥物霧化后能否形成0.5～10 μm微粒（霧化顆粒直徑對藥物沉積位置有直接影響，有效霧化顆粒直徑應在0.5～10 μm，其中粒徑為5～10 μm的微粒主要沉積于口咽部，粒徑為3～5 μm的微粒主要沉積于肺部，粒徑小于3μm的微粒50%～60%沉積于肺泡），以及其穩定性、安全性、有效性尚待進一步研究。臨床常用霧化器主要有射流霧化器（壓縮式霧化器）、超聲霧化器及振動篩孔霧化器（網式霧化器）3種[14]。超聲霧化器的劇烈震蕩可使霧化器中的液體加溫，可能會影響某些藥物中所含蛋白質或肽類化合物的結構和穩定性[15]。振動篩孔霧化器是通過壓電陶瓷片的高頻振動，使藥液穿過細小的篩孔而產生藥霧的裝置，減少超聲振動液體產熱對藥物的影響，篩孔的直徑可決定產生藥霧顆粒的大小[16]。以壓縮泵或氧氣驅動的霧化器是目前臨床最常用的霧化吸入器具，其原理是高速運動的壓縮氣體通過狹小開口后突然減壓，在局部產生負壓將藥液吸出，并通過高速運動的持續氣流形成藥霧微粒，其中大藥霧微粒通過擋板回落至貯藥池，小藥霧微粒則隨氣流輸出，藥霧微粒的大小與氣流的壓力和流速有關，增加氣流速度可使霧化輸出量增加，減小藥霧微粒，縮短霧化時間[17]。本研究結果顯示，注射用rhINF α-1b藥液用2種霧化器霧化后微粒粒徑均呈正態分布，但用壓縮式霧化器霧化效果更好，藥液全部霧化后粒徑小于12 μm，超過80%的微粒粒徑分布于1～5 μm，該區間霧化微粒既可到達肺泡組織，又不易隨氣流呼出，絕大部分藥液可作用于肺泡，但不同廠家、不同型號的霧化器的霧化效果可能不同。

臨床通常將注射用rhIFN α-1b與常見兒童霧化藥物配伍，如與吸入用布地奈德混懸液、吸入用異丙托溴銨溶液、吸入用硫酸沙丁胺醇溶液、硫酸特布他林霧化液、注射用鹽酸氨溴索等配伍。目前未見配伍后及霧化后注射用rhIFN α-1b生物活性和結構穩定性變化的相關報道，后續研究需進一步對注射用rhIFN α-1b配伍后的混合溶液進行外觀、pH、霧化前后生物活性檢測，以及霧化后rhIFN α-1b結構變化檢測，為臨床合理用藥提供參考。

霧化吸入rhIFN ɑ-1b盡管被《兒童霧化中心規范化管理指南》《重組人干擾素α-1b在兒科的臨床應用專家共識》等推薦使用，但不可忽視在我國屬超藥品說明書用藥，會面臨一定風險和法律問題，故醫院需強化超藥品說明書用藥管理，做好備案；超藥品說明書用藥需謹慎，并做好患者的知情同意；藥師應及時與醫師溝通，做好處方點評，合理監控超藥品說明書用藥。