生孢梭菌生長所需最低水分活度研究*

楊 靜，李 翠，周志云，馬曉娟，楊曉莉△

（1.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安710065；2.陜西盛德泰林生物安全技術檢測有限公司，陜西 西安710065）

水分活度（Aw）是評價食品和化妝品微生物風險和產品穩定性的重要依據，在藥品微生物控制中，Aw測定已有一定應用前景[1-2]。Aw與微生物的生長密切相關，微生物又是反映藥品安全性和有效性的重要指標，大多數細菌在Aw低于0.91時停止生長，大多數霉菌在Aw低于0.80時停止生長[3]。通過測定Aw，可更好地反映藥品質量，且該測定無破壞性，省時省力，設備簡單價廉，對于制藥產品研發、生產環境控制、包裝材料選擇與藥品成品保存等都有重要意義[4]。查詢文獻[5-8]，可得到一些與制藥相關的代表性微生物生長所需的最低Aw，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和沙門氏菌在水分活度低于0.91的產品中不會增殖或存活，革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌在Aw低于0.86時不會增殖，黑曲霉在Aw低于0.77時不會增殖[9]。但與制藥相關的厭氧菌株由于生長條件嚴苛，其生長所需最低Aw研究較少。生孢梭菌為厭氧微生物的代表，為梭狀芽孢桿菌屬，噬菌體約為1 μm×5 μm的革蘭陽性桿菌，該菌未收錄于《美國藥典》1112的微生物生長所需的最低Aw，查閱國內外文獻未找到其生長的最低Aw，因此目前無參考的最低Aw。本研究中參考《美國藥典》1112收錄肉毒梭菌生長所需最低Aw（0.95）[10]及文獻[11-13]，將培養基的Aw調至0.90～0.99，進行預試驗及正式試驗。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕，購自中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

試劑：硫乙醇酸鹽流體培養基（批號為180830），梭菌增菌培養基（批號為170701），哥倫比亞瓊脂培養基（批號為170717），均購自北京陸橋技術股份有限公司。丙三醇（批號為20180730），氯化鈉（批號為20180509）均購自國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20170510）。

儀器：Aqualab4TE型水分活度儀（美國Decagon公司）；HFSAFE1200LC型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；SX-500型蒸汽滅菌器（YOMY）；LRH-250F型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；PL202-S型電子天平（瑞士梅特勒公司，d=0.01 g）；厭氧產氣包（Mitsubishhi Gas Chemical CO.，INC.批號為8089ZJ-1）。

1.2 方法

梭菌增菌培養基配制：分別用氯化鈉、蔗糖、丙三醇調節梭菌增菌培養基，滅菌后測量Aw[14-15]，使其Aw值為0.90～0.98，同時配制不調Aw的梭菌增菌培養基，作為T0。

菌液制備：開啟生孢梭菌菌種，將3代微球菌轉接至12 mL硫乙醇酸鹽流體培養基，30～35℃培養24 h，用無菌生理鹽水稀釋成每1mL含104cfu菌落數的菌懸液。

接種：取制備好的新鮮菌懸液0.3 mL，加入上述梭菌增菌培養基30 mL中，混勻，其中T0為對照組，其余均為試驗組。

培養：將各組試驗管置厭氧培養袋中，35℃培養，分別于0，4，6，18，24，48，72，96，120 h時間點，取1 mL稀釋至適宜的稀釋級接種平皿（直徑90 mm），注入溫度不超過45℃哥倫比亞瓊脂培養基約20 mL，待培養基凝固后裝入厭氧培養袋，于35℃厭氧培養72 h，計數。

繪制生長速率曲線：不同介質在獲得生孢梭菌生長所需最低Aw后，選擇最低Aw T附近的3個水平，即低于Aw限值0.01單位TL，高于Aw限值0.01單位TH分別進行重復3次試驗，以測得的菌落數（cfu）的對數值，對時間（h）作圖，繪制生長速率曲線。

2 結果

2.1 氯化鈉培養介質下生孢梭菌所需最低Aw

以氯化鈉調節梭菌增菌培養基Aw，測定在4種不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.97）下生孢梭菌的生長速率。3次重復試驗結果均顯示，Aw值為0.94時，生孢梭菌不生長；比較3次試驗結果，第3次試驗結果顯示，Aw值為0.95時，生孢梭菌出現緩慢生長跡象（圖1）；Aw≥0.96時，生孢梭菌可正常生長。可見，以氯化鈉調節梭菌增菌液的Aw，生孢梭菌生長所需的最低Aw范圍為0.95～0.96。另外，由生長速率曲線可見，生孢梭菌一般在培養24 h后進入對數生長期，在培養48 h后可達到生長穩定期。

2.2 蔗糖培養介質下生孢梭菌所需最低Aw

以蔗糖調節梭菌增菌培養基Aw，測定在4種不同Aw（0.94，0.95，0.96，0.99）下生孢梭菌的生長速率。3次重復試驗結果均顯示，Aw為0.94時，生孢梭菌不生長（圖2）；Aw為0.95時，生孢梭菌出現緩慢生長跡象；Aw≥0.96時，生孢梭菌可正常生長。可見，以蔗糖調節梭菌增菌液的Aw，生孢梭菌生長所需的最低Aw范圍為0.95～0.96。

2.3 甘油培養介質下生孢梭菌所需最低Aw

以甘油調節梭菌增菌培養基Aw，測定在3種不同Aw（0.91，0.92，0.93）下生孢梭菌的生長速率。3次重復試驗結果均顯示，Aw為0.91時，生孢梭菌不生長（圖3）；Aw≥0.92時，生孢梭菌可正常生長。可見，以甘油調節梭菌增菌液的水分活度，生孢梭菌生長所需的最低Aw為0.92。

3 討論

生孢梭菌是嚴格厭氧菌，菌齡、培養基、培養條件對試驗結果的影響非常大，每次試驗都必須制備新鮮菌種，保證菌齡及菌的活性；梭菌增菌液培養基主要是瓊脂和半胱氨酸，起到保證培養基體系厭氧環境的作用，隨著時間的增長，體系的還原物質會被消耗，這使得0 h剛加入的菌的存活率受到威脅，故每次試驗都必須采用新鮮配制的培養基；培養條件采用厭氧培養袋，每個時間節點進行計數的同時，對厭氧環境有更高要求，也會對試驗結果的穩定性產生影響，針對該項問題，快速試驗，盡可能每個時間點重新放置厭氧產氣袋，保證厭氧培養條件；不同的介質，生孢梭菌生長所需最低Aw不同，其中甘油的試驗結果相對穩定，生孢梭菌生長所需最低Aw最低，尤其在0 h時，同樣的接菌量，甘油測得的菌落數常高于蔗糖和氯化鈉，有時甚至高于對照組，甘油本身有助于厭氧條件的保存。

圖3 甘油培養介質下生孢梭菌生長所需最低水分活度

2015年版《中國藥典（四部）》中，生孢梭菌在陰道、尿道及固體局部給予非無菌制劑中被列為控制菌[7]，故本研究對于制藥產品研發、生產環境控制、包裝材料選擇及藥品成品貯存及日常微生物限度檢查均有價值[16]。與在制藥工業中廣泛采用的水含量的物理意義相比，Aw更有助于理解制藥產品的相關領域的科學內涵。《美國藥典》《歐洲藥典》已意識到了Aw及其應用的重要性，先后推出了Aw規定。故建議建立合理微生物相關Aw控制策略，從而進一步推動我國微生物控制的發展。