知黃潰瘍合劑質(zhì)量標準研究*

郭廷東，王婭俐，彭賢東，張仕瑾，吳 亮，唐志立

（四川省南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部·個性化藥物治療南充市重點實驗室，四川 南充637000）

知黃潰瘍合劑是由熟地黃、知母、黃柏、玄參、茯苓、五味子、鹽巴戟天、白及、川牛膝9味中藥組方，是我院醫(yī)師為解決傳統(tǒng)湯劑攜帶不便的問題，根據(jù)臨床經(jīng)驗對經(jīng)典古方“引火湯”[1-2]改進所制的合劑，用于治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍[3]。課題組優(yōu)選了提取工藝，并對其進行了口腔潰瘍模型大鼠的藥效學(xué)和急性毒性試驗研究，結(jié)果顯示，合劑能顯著改善大鼠口腔潰瘍組織的損傷，且無明顯的急性毒性[4-6]。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中熟地黃、黃柏、玄參進行了定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對臣藥黃柏中有效成分鹽酸小檗堿進行了含量測定，為知黃潰瘍合劑的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BP211D型天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司，精度為十萬分之一）；1730QT型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

知黃潰瘍合劑（四川省南充市中心醫(yī)院制劑室提供，批號分別為180806，180808，180810）；鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212），熟地黃對照藥材（批號為121196-201406），黃柏對照藥材（批號為121510-201606），玄參對照藥材（批號為121008-201609），均購于中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇和乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

熟地黃：取樣品10 mL，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1 mL溶解殘渣，即得供試品溶液。另取熟地黃對照藥材3 g，加水50mL，提取30 min，放冷，濾過，同供試品溶液制備方法制得熟地黃對照藥材溶液。取缺熟地黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，均勻噴灑2，4-二硝基苯肼乙醇試液，在日光下觀察。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

黃柏：取樣品10 mL，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使其溶解，即得供試品溶液。取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，過濾，同供試品溶液制備方法制得黃柏對照藥材溶液。取缺黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得黃柏陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）通則0502 TLC法試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，以甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶2∶3∶2∶0.3，V/V/V/V/V）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，在紫外燈（365 nm）下觀察。供試品溶液色譜圖中，在與對照品及對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

玄參：取樣品20 mL，加乙醚振搖提取2次，每次20 mL，去掉乙醚層溶液，再用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇層溶液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使其溶解，即得供試品溶液。另取玄參對照藥材1 g，加乙醇20 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL溶解，同供試品溶液制備方法制得對照藥材溶液。取缺玄參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得玄參陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中TLC法，吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，均勻噴灑5%香草醛硫酸溶液，加熱到斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：GL Sciences Inc.Intertsil?ODS-3 RP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（30∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，鹽酸小檗堿與雜質(zhì)分離度均大于1.5，理論板數(shù)不低于4 000。

2.2.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含540 μg的溶液，即得對照品溶液。精密吸取樣品10 mL置25 mL容量瓶中，用鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）定容至刻度，振搖過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺黃柏藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：按擬訂色譜條件對2.2.2項下3種溶液進樣分析，記錄色譜圖（見圖2）。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，陰性對照無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項下對照品溶液2，4，6，8，10，12，18，20μL，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程Y=478 454X+12 419，r2=0.999 9（n=8）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進樣量在1.08～10.8 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2.2項下對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果的RSD為0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為180806）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，6，12，18，24 h時進樣測定。結(jié)果的RSD為0.38%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為180806）樣品，依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均含量為1.646 mg/mL，RSD為0.72%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知鹽酸小檗堿濃度的樣品6份，每份1 mL，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液3 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為180806，180808，180810）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果3批樣品中鹽酸小檗堿的含量分別為1.764，1.807，1.632 mg/mL。

3 討論

3.1 指標成分選擇

知黃潰瘍合劑具有補腎水、瀉火解毒、滋陰降火等功效，對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍有良好的療效[6]。方中君藥熟地黃的有效成分為毛蕊花糖苷，但其為糖苷，受pH及溫度影響較大，且其含量檢測方法的專屬性不好，故不作為控制本品質(zhì)量的指標成分[4]。黃柏可降低血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，減輕炎性損傷，可治療口腔潰瘍[7]。成洪達等[8]將黃柏提取物制成雙層口腔潰瘍膜，用于治療口腔潰瘍。且黃柏中有效成分鹽酸小檗堿是季銨堿，在酸性和高溫條件下穩(wěn)定，故本試驗中選擇鹽酸小檗堿作為指標成分。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

供試品處理過程中，考察了不同提取溶劑對提取效率的影響。結(jié)果水＜50%甲醇＜流動相＜鹽酸-甲醇＜甲醇，但用鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）所提取的供試品溶液，雜質(zhì)峰相對減少，故選擇鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）作為供試品溶液的提取溶劑。提取方法考察了超聲、回流及振搖提取，結(jié)果超聲提取和回流提取含量高，但無顯著差異，超聲提取簡便，故提取方法選擇超聲提取。同時考察了提取時間（0，15，30，45 min）對成分溶出速率的影響，結(jié)果表明，超聲處理45 min的含量并無顯著變化。故最終確定文中的供試品溶液制備方法。

3.3 檢測波長選擇

采用紫外分光光度計全掃描，鹽酸小檗堿在227mm和265nm波長處均有最大吸收，但溶劑鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）在227 nm波長處也有一定吸收，而在265 nm波長處無吸收，故最終選擇265 nm處作為檢測波長。