磁性多壁碳納米管固相萃取-液質聯用法測定植物油中的黃曲霉毒素B1

吳靜娜 楊秀娟 韋璐陽 蔣越華 農耀京

摘 要：以化學共沉淀法制備的MWCNTs-Fe3O4為磁性吸附劑，結合高效液相色譜串聯質譜測定植物油中的黃曲霉毒素。樣品加入正己烷后，用pH=3.0、體積分數為12.5 %的乙腈—水溶液提取，最后加入MWCNTs-Fe3O4進行磁性固相萃取。優化了萃取劑、吸附劑用量、吸附時間、洗脫劑、洗脫時間等磁性固相萃取條件。結果表明，黃曲霉毒素AFB1其線性范圍內線性關系良好，相關系數為0.9987，方法檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.04 μg/kg。在樣品中分別添加水平為5，10 和 20 μg/kg 的AFB1，回收率為81.5 %～104.5 %，相對標準偏差為1.5 %～4.3 %。該方法簡便、快速、準確，可用于植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測。

關鍵詞：磁性固相萃取 黃曲霉毒素 多壁碳納米管 高效液相色譜串聯質譜

中圖分類號：O657? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract：Aflatoxins in vegetable oil were determined by HPLC tandem mass spectrometry with MWCNTs-Fe3O4 which prepared by chemical co-precipitation as magnetic adsorbent. After adding n-hexane，the samples were extracted by acetonitrile-water solution with a pH of 3.0 and a volume fraction of 12.5%，and purified by MWCNTs-Fe3O4. The magnetic solid phase extraction conditions such as extraction agent，adsorbent dosage，adsorption time，eluent and eluent time were optimized. The results showed that aflatoxin AFB1 had a good linearity with the correlation coefficient of 0.9987. The LOD was 0.01μg/kg and the LOQ was 0.04μg/kg. The average recoveries at spiked levels of 5，10，20 μg/kg ranged from 81.5% to104.5% with relative standard deviations between 1.5% and 4.3%. The method is simple，rapid and accurate for the determination of AFB1 in vegetable oil.

Key words：Magnetic solid phase extraction;aflatoxin;multi-walled carbon nanotubes; HPLC-MS/MS

真菌毒素的污染已經成為食品安全關注的熱點。玉米、花生、大米及植物油脂等糧油農產品及其制品在生產、流通、儲存過程中由于易污染產生黃曲霉毒素及其代謝物。目前發現的黃曲霉毒素中，毒性最強的是黃曲霉毒素B1（AFB1），被世界衛生組織的癌癥研究機構認定為 I 類致癌物[1-2]。隨著食品安全管控越來越嚴格，世界各國對AFTs制定了嚴格的限量標準[3]，其中日本要求最為嚴格：所有食品中均不能檢出黃曲霉毒素;歐盟對不同類食物中AFB1的限量值為2.0～8.0 μg/kg;我國的限量標準[4]要求谷物及其制品、糧油中AFB1的限量值為5.0～20.0 μg/kg。

黃曲霉毒素的標準檢測方法[5]主要為高效液相色譜法[6]、同位素稀釋液相色譜—串聯質譜法[7-8]和酶聯免疫吸附測定法[9]。這些方法各有其優缺點，質譜法盡管靈敏度高，但是往往需要經過繁瑣的前處理減少機制干擾;酶聯免疫分析耗時短，但抗體價格高、種類少，假陽性檢出率高等。植物油中的黃曲霉毒素由于濃度低且基質里含有的油脂、脂肪酸和色素等，會對測定造成嚴重干擾，降低分析的靈敏度[10]。因此，亟需建立一種同時檢測和分離富集黃曲霉毒素的樣品前處理方法。

磁性固相萃?。∕SPE）技術[11]是一種快速高效的前處理方法。本研究在羧基化多壁碳納米管的基礎上合成MWCNTs-Fe3O4磁性納米顆粒，利用多壁碳納米管的π-π相互作用、氫鍵相互作用等作用力使黃曲霉毒素AFB1從基質中分離和富集。該法具有快速、簡便、回收率高等特點，能夠滿足植物油中AFB1的檢測分析，具有一定的實用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超高壓高效液相色譜儀（日本島津公司）;AB SCIEX-API3200 三重四級桿串聯質譜儀（美國AB SCIEX公司）;Thermo Helios G4CX電子顯微鏡（美國Thermo Scientific 公司）;聚焦離子束納米制備和加工系統（德國CarlZeiss公司）;振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）;真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;加熱磁力攪拌器（德國IKA公司）;多壁碳納米管（—COOH，20～30 nm，>98%，中國科學院成都有機化學有限公司）;甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷（色譜純，美國 Thermo Fisher公司）;FeCl3·6H2O，FeCl2·4H2O、NaOH（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;黃曲霉毒素AFB1標準品（青島普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 WCNTs-Fe3O4的制備

采用共沉淀法制備WCNTs-Fe3O：稱取5.2 g FeCl3·6H2O和2.0 g FeCl2·4H2O溶于25 mL除氧水中，加入1.0 mL 12 mol/L HCl加熱溶解，配置成Fe3+溶液備用。于250 mL 1.5 mol/L NaOH溶液加入2.0 g羧基化多壁碳納米管（WCNTs-COOH），轉入三頸燒瓶中，于85 ℃ 水浴（N2保護）加熱超聲攪拌30 min后，將Fe3+溶液逐滴加入生成MWCNTs-Fe3O4，用強磁鐵吸附生成的WCNTs-Fe3O4納米顆粒，棄去反應液，然后用去離子水清洗直至pH=7.0。最后將此磁性吸附材料于50 ℃真空干燥24 h，備用。

1.3 標準溶液的配制

混合標準曲線的工作配制：分別配制上機濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1標準溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅡ十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（2.0 mm×75 mm×2.2 μm）;柱溫：40 ℃;進樣體積：5.0 μL;流速：0.30 mL/min;流動相采用不同比例的乙腈和0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脫條件：0.01 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為2∶98;5.00～5.50 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為75∶25;8.00 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）為2∶98。

1.5 質譜條件

質譜條件：電噴霧電壓：5500.0 V，離子源溫度：550 ℃，氣簾氣壓力55 psi，霧化氣壓力55 psi，加熱氣壓力55 psi。電噴霧離子源（ESI），采用正離子MRM多反應監測掃描， AFB1母離子及子離子見表1。

1.6 樣品前處理

稱取植物油5.0 g，加入2.0 mL正已烷，混勻3 min后，再加入10.0 mL pH為3.0體積分數為12.5%乙腈水溶液，渦旋混勻，加入15.0 mg MWCNTs-Fe3O4，低速振蕩吸附5 min，用強磁鐵吸附磁性吸附劑，棄去上清液。加入1.0 mL乙腈振蕩洗脫5 min。洗脫液氮吹近干，用甲醇定容至1.0 mL，HPLC-MS/MS上機檢測。

2 結果與討論

2.1 吸附劑MWCNTs-Fe3O4掃描電鏡測試

將1.2所制備的MWCNTs-Fe3O4納米顆粒經電鏡掃描測定如圖1所示，由圖可知，該磁性納米顆形狀為球形，平均粒徑為38 nm。

2.2 磁性固相萃取條件的優化

2.2.1 萃取劑的選擇

黃曲霉毒素AFB1屬于中等極性化合物，易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等有機溶劑，本實驗對比了12.5%甲醇—水、甲醇、12.5%乙腈—水、乙腈作為萃取劑時的萃取效果，萃取效率對回收率的影響見圖2。由圖可知，12.5%的乙腈-水提取效果最好，可能原因是適量的水能增大萃取劑在樣品中的滲透能力，甲醇和乙腈濃度過高時，萃取劑與吸附劑間的競爭加強，造成回收率降低。因此本實驗選擇12.5%的乙腈—水體系作為萃取劑。

2.2.2 萃取劑pH的影響

AFB1在酸性條件下能穩定存在，因此需要對萃取劑的酸度選擇進行優化，以保證萃取效率。本實驗將12.5%乙腈—水萃取劑的pH分別調至1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，pH對回收率的影響見圖3。結果表明，pH在3.0到5.0時，AFB1的回收率均能達到80%以上， pH 為3.0時回收率最高。pH值繼續增大，回收率開始降低，原因可能由于堿性增強使部分AFB1分解造成的。因此，本實驗選擇萃取劑的pH為3.0。

2.2.3 吸附時間的影響

在pH=3.0的12.5% 乙腈—水作為萃取劑的條件下，考察了吸附時間分別為1，3，5，10，15 min時對AFB1回收率的影響。結果見圖4。由圖可知，1 min至5min 時，AFB1的回收率隨著時間增加而增大，回收率達到85%～95%間，基本達到吸附平衡。5min之后，AFB1的回收率基本不再變化。因此，吸附時間選擇為5 min。

2.2.4MWCNTs-Fe3O4吸附劑用量的影響

吸附劑的用量也對萃取效率產生顯著影響。本實驗分別考察了吸附劑用量為1.0，5.0，15.0，20.0， 30.0 mg時的萃取效果。實驗結果見圖5，隨著吸附用量的增加，AFB1的回收率逐漸增大，直至達到吸附平衡，此時吸附劑用量為15.0 mg。隨著吸附劑用量繼續增加，AFB1的回收率有下降的趨勢，其原因可能是由于吸附劑用量大，容易造成洗脫階段洗脫不完全。因此，吸附劑用量選擇15.0 mg。

2.2.5 洗脫劑的選擇

洗脫劑的極性直接影響洗脫效率。本實驗選擇了5種極性不同的洗脫劑考察洗脫效果，分別為：乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮。洗脫效果見圖6。洗脫效果為乙腈>甲醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>丙酮。主要原因是黃曲霉毒素AFB1為中等極性化合物，洗脫劑極性越大，洗脫能力越強。因此，本實驗選擇乙腈為洗脫劑。

2.2.6 洗脫時間的影響

適合的洗脫時間不僅能提高回收率，也可以縮短前處理時間。洗脫時間過長，造成回收率下降。實驗分別考察了洗脫時間為1，3，5，10，15 min時對AFB1回收率的影響。由圖7可知，5 min時，洗脫效果最好，AFB1的回收率最大。繼續增加洗脫時間會導致部分已經洗脫的AFB1重新被吸附，造成回收率降低。因此，洗脫時間選擇5 min。

3 方法評價

3.1 線性范圍

配制濃度分為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1標準溶液，標準溶液的色譜圖見圖8。以質譜峰面積為縱坐標，AFB1濃度為橫坐標作線性回歸，回歸方程、線性范圍及相關系數見表2，由表中數據可知，AFB1 在0.5～50.0μg/L范圍內線性關系良好，相關系數為0.9987。以3倍信噪比（S/N= 3）對應的濃度為方法檢出限（ LOD） ，10 倍信噪比（S/N=10）對應的濃度為定量限（ LOQ） ，檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.04 μg/kg。

3.2 方法的靈敏度、精密度和準確度

選用食用調和油、花生油和玉米油的空白樣品作為基質，分別添加3個不同水平的AFB1，按照1.6方法進行樣品前處理，利用HPLC-MS/MS平行測定6次，計算回收率以及相對標準偏差（RSD），具體結果見表3。

3.3 方法驗證

隨機購買市場銷售的食用油樣品10份（種類包含食用調和油、玉米油和花生油）進行檢測，檢出1份花生油樣品含AFB1，含量為5.88 μg/kg，低于我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中規定的花生油中AFB1的限量值20 μg/kg。其余9份樣品中AFB1未檢出。

4 結論

本文采用共沉淀法制備了磁性固相萃取吸附劑MWCNTs-Fe3O4，建立了磁性固相萃取結合HPLC-MS/MS檢測食用植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測方法。該前處理方法操作簡便，減少了有毒有害有機試劑的使用，同時由于磁性固相萃取的分離和富集作用，降低了油脂樣品中脂溶性物質、基質、雜質等干擾因素，使方法的靈敏度和精密度得到提高，能夠滿足植物油中黃曲霉毒素AFB1的檢測要求。

參考文獻

[1]? ? ? 李彥伸，盧國柱，曲勁堯，等.霉菌毒素檢測與脫毒技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（12）：3919-3927.

[2]? ? ? Ren Y， Zhang Y， Shao S， et al. Simultaneous determination of multi-component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spec-trometry [J]. Journal of Chromatography A， 2007， 1143（1）： 48-64.

[3]? ? ?吳限鑫，林秋君，郭春景，等.國內外主要糧油產品中真菌毒素限量-檢測標準及風險評估現狀分析[J].中國糧油學報，2019，34（9）：130-136.

[4]? ? ? 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局. 食品安全國家標準食品中真菌毒素限量 GB2761-2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[5]? ? ?中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局. 食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定GB5009.22-2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[6]? ? ?韓曉萌，楊臻慧，陸敏芳，等.HPLC檢測植物油中黃曲霉毒素B1含量的不確定度評價[J].廣州化學，2020，45（5）：69-73.

[7]? ? ?史娜，侯彩云，路勇，等.QuEChERS-高效液相色譜—質譜法檢測食品中14 種真菌毒素[J]. 食品科學，2014，35（16）：190-196.

[8]? ? ?孟繁磊，宋志峰，譚莉，等.穩定同位素稀釋-UPLC-MS/MS法測定飼料中4種黃曲霉毒素[J].飼料工業，2019，40（6）：50-53.

[9]? ? ? 潘明飛，李詩潔，郭丹丹，等.間接競爭酶聯免疫分析方法檢測花生中黃曲霉毒素B1[J].中國食品學報，2019，19（9）：255-261.

[10]? ?何曉明，倪娟楨，趙月鈞，等.MSPE-UPLC-MS/MS法測定植物油中8種真菌毒素[J]. 食品工業，2019，40（5）：319-321.

[11]? ?劉勤，何麗君，楊君，等.離子液體基磁性固相萃取技術的研究進展[J]. 分析測試學報，2015，34（7）：860-866.