350余種免疫缺陷病基因圖譜新添一員

文/復旦大學附屬兒科醫院 編輯/清風

現代醫學之父威廉·奧斯勒醫生說：人類有三大敵人——發熱、饑餓及戰爭，其中發熱為三敵之首。盡管檢測手段和方法不斷進步，不明原因發熱的診斷至今仍是常見而且重要的臨床難題之一。近日，國際權威學術期刊《自然》雜志發表了由中國科學家發現的一種全新原發性免疫缺陷病，該病可引起患者發熱和炎癥反應。據悉，這是復旦大學附屬兒科醫院臨床醫生和浙江大學及哈佛大學基礎研究科學家通力協作取得的研究成果，闡明了受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RIPK1）基因突變，導致RIPK1無法被切割引起的炎癥和周期性發熱，并對這一基因突變在炎癥產生、細胞死亡等機制進行了詳盡的研究，這也是人類首次發現這種類型的變異。本文通訊作者之一、復旦大學附屬兒科醫院免疫科主任王曉川教授坦言，此項研究對于因免疫相關性疾病導致的不明原因發熱的患兒來說，將帶來全新的診治思路和有效診治方法。

兒科力量為免疫缺陷病基因圖譜新添一員

引起不明原因發熱的原因主要包括感染、腫瘤及免疫相關性疾病。隨著疾病譜的改變，免疫相關性疾病逐漸成為不明原因發熱的重要因素之一，王曉川教授團隊表示，“已經明確一些免疫相關性發熱與基因突變有關，也就是有著宿主出生免疫缺陷的基礎”。

隨著人類基因組學和免疫學知識的不斷完善，以及二代測序等技術手段的支撐，免疫相關性疾病在過去20多年中飛速發展。科學家們能夠鑒定出導致不同免疫相關性疾病的遺傳變異，為受累患者的臨床治療和罕見病的基因檢測提供必要的數據支撐。

2歲的童童（化名）是家里的第一個孩子，出生后2月齡起出現反復發熱，每次發熱持續數天，間隔8－10天再次反復，在當地多次住院治療仍不能明確原因。2017年10月來到復旦大學附屬兒科醫院臨床免疫科住院治療，進行了全面臨床評估，排除了感染、風濕以及腫瘤性疾病所致發熱。患兒除了發熱以外，還有淋巴增殖的表現，多種促炎癥細胞因子增高，這些信息提示免疫系統可能存在固有的缺陷。

初步的全外顯子高通量基因測序和免疫分析排除了各種已知的免疫缺陷病，患兒的反復發熱情況并未改善，作為本文第一作者、上海市援青干部、復旦大學附屬兒科醫院免疫科孫金嶠教授坦言，在臨床發現問題后，復旦兒科團隊聯合浙江大學周青教授團隊和哈佛大學袁鈞瑛教授團隊，進一步分析患兒的基因測序數據并開展了一系列的基礎研究，最終發現患兒RIPK1的p.D324V位點存在新發變異。 “這也是人類首次發現這種類型的變異。” 孫金嶠教授表示，RIPK1（Receptor-Interactingserine/threonine-Protein Kinase-1）是受體相互作用蛋白（RIP）激酶家族的一員，參與了決定細胞“生死存亡”的多種重要信號通路，其激酶活性在RIPK1依賴的細胞凋亡和細胞程序性壞死進程中發揮重要的調節作用。以往的研究發現，小鼠RIPK1對應位點（Asp325）突變會引起胚胎致死，主要是由于增多的細胞凋亡和程序性壞死，同時敲除Ripk3和Fadd，或者Mlkl和Fadd可以逆轉這一致死表型。然而，人類RIPK1該切割位點變異對這些重要信號通路及人類健康的影響未有報道。

▲ 基因測序數據圖譜

一系列問題擺在臨床醫生及基礎研究科學家們面前：需要證實這個變異是否是這類患者的致病原因以及遺傳方式；為什么相同的突變類型人與小鼠卻有著不同后果？小鼠可引起死胎，而人類僅僅發熱！另一個問題，同是RIPK1這個基因，已經明確了它在激酶區的復合雜合突變會導致重癥聯合免疫缺陷病。而p.D324V位點的雜合突變僅僅導致反復發熱？這些問題都等待作者們進一步證實和闡明。

孫金嶠教授分析道，首先這個患兒沒有聯合免疫缺陷病的臨床表現和免疫表型，只是表現為自身炎癥的臨床和實驗室表現，同時也有一定程度的淋巴增殖性表現。患兒的生長發育正常，無家族史和其他嚴重疾病史。一系列深入的免疫評估指向了自身炎癥性發熱的可能。因此不同于已經報道的RIPK1激酶區復合雜合突變的聯合免疫缺陷病例。

功能實驗研究顯示RIPK1的p.D324V位點變異促進了TNF所致的外周血淋巴細胞死亡和炎癥反應，尤其是以IL-6為代表的促炎癥細胞因子產生明顯增加。至少在這種病例其炎癥的發生，除了RIPK1的變異造成促炎癥細胞因子增加外，細胞死亡又使得炎癥加強，二者之間存在相互促進的作用，可以很好地解釋其周期性發熱等自身炎癥的表現，這也為臨床可能的治療手段提供了依據。此外，在RIPK1基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）也看到了類似的變化。這些研究基本解決了患兒RIPK1 p.D324V變異致病的問題，但還無法解釋小鼠這一位點突變所引起的死胎而人類僅僅表現為自身炎癥的現象。

進一步的研究發現，取患兒成纖維細胞培養所獲得的結果與其外周血單個核細胞及MEFs結果相反，患兒在TNF的刺激下成纖維細胞的死亡和促炎癥因子IL-6的產生均較正常對照減少。并且成纖維細胞RIPK1和TNFR1的表達也被下調。這一結果表明人與小鼠的結果并不完全相同，也解釋了RIPK1 p.D324V變異在人與小鼠致病的差異，同時表明RIPK1參與細胞和機體炎癥調控的組織差異和復雜性。

中國臨床、基礎科學家協作研究

2019年12月12日，浙江大學生命科學研究院周青課題組、哈佛大學醫學院袁鈞瑛教授團隊和復旦大學附屬兒科醫院王曉川課題組聯合在《自然》雜志上發表研究論文A dominant autoinflammatory disease caused by noncleavable variants of RIPK1，本研究首次發現人類RIPK1非切割變異導致自身炎癥性疾病并解析其發病分子機制。結果表明不能切割的RIPK1可以促進其激酶活性，導致細胞凋亡、細胞程序性壞死增加、炎癥因子上調，為臨床提供更加合理、科學的治療建議，從而極大緩解患者的臨床癥狀；同時還發現患者不同種類細胞響應外來刺激的異質性，豐富了RIPK1在調節不同種類細胞死亡中的作用。據王曉川教授介紹，結合這些研究的結果，兒科醫院免疫科在2019年3月起給患兒采取了托珠單抗治療，他的發熱頻率和持續時間均較前好轉。

如何從眾多的患者中把因免疫異常致病的患者診斷出來，需要的技術手段不是常規技術手段所能勝任的。將最新的免疫和分子診斷技術引入臨床免疫診斷是王曉川教授近年來一直在探索的問題。從2002年開始，在國內首先對先天性免疫缺陷進行基因診斷，使許多原本停留在書本和文獻中的疾病在中國得到明確診斷。如今，幾十種原發性免疫缺陷病都已經得到快速明確的診斷，使許多患者的疾病都得到了有效的控制和治療。

根據國際免疫學會聯合會專家組2017年版分類，可分為九大類，共354種疾病，明確致病基因344個。近年來隨著高通量基因測序技術的進步，每年都有數十種新的致病基因被發現，而此項研究是由中國臨床醫生和基礎科學家通力協作主導發現的全新原發性免疫缺陷病，“希望通過臨床發現問題，再由基礎科學家介入，最終找到有效的治療手段和辦法幫助到更多患兒。”王曉川教授表示。

據悉，作為國內唯一獨立的臨床免疫科，兒科醫院臨床免疫科1981年開展臨床免疫專科門診，2011年創建臨床免疫/過敏科，2014年成立了全國首家兒童免疫缺陷病專科病房。診治范圍包括：免疫低下/免疫缺陷、預防接種相關問題、過敏性疾病、不明原因發熱等。我院是國內最早開展原發性免疫缺陷病診治單位之一，在多年的工作中，建立了原發性免疫缺陷病的臨床和實驗室評估和治療體系。