針刺干預(yù)對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化癥模型小鼠腦及脊髓中IBA-1和TNF-α表達(dá)的影響*

賀韻涵，李曉峰，符 濤，楊曉航，戚瑩媛，王 強(qiáng)，4△

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)（咸陽(yáng)712046）；2.北京崇文光明醫(yī)院保健科（北京100061）；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（咸陽(yáng)712000）；4.陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（咸陽(yáng)712046）

肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophiclateral sclerosis，ALS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要表現(xiàn)為全身肌肉漸進(jìn)性無(wú)力、萎縮、肌肉痙攣等，最終多因呼吸麻痹致死［1］。目前該病主要依靠藥物利魯唑（Riluzole）治療，但其副作用大，經(jīng)濟(jì)成本高，因此迫切的需要尋找一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的方法。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［2］，針灸在治療神經(jīng)元退行性疾病中發(fā)揮了一定的作用。而針刺治療ALS 的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本研究選擇電針刺激雙側(cè)天樞穴及足三里穴作為針刺治療組。再通過(guò)對(duì)比正常組、模型組、針刺組及利魯唑組之間IBA-1 及TNF-α 表達(dá)的差異，觀察電針對(duì)IBA-1及TNF-α表達(dá)水平的影響，探討針刺治療該病的臨床價(jià)值及作用機(jī)制。

材料和方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠由Jackson 實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)。將18 d小鼠剪尾0.3-0.5 cm，依照J(rèn)ackson實(shí)驗(yàn)室的方法進(jìn)行基因鑒定。應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定子代鼠，符合SOD1G93A基因表型為模型鼠，不符合為正常組，將模型鼠再分為模型組、針刺組、利魯唑組，每組各8-10 只。實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)條件為（24±2）℃，光照12 h及黑暗12 h交替，定時(shí)給予清潔飲水及飼料。實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠處理，嚴(yán)格遵循國(guó)家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 主要試劑及儀器：利魯唑（法國(guó)，賽諾菲）；兔抗IBA-1 和TNF-α（英國(guó)，ABCAM）；即用型SABC（兔IgG）試劑盒（武漢，博士德）；DAB 顯色液（武漢，博士德）；冰凍切片機(jī)（美國(guó)，Thermo Scientific，型號(hào)HM525 NX）；顯微攝像成像系統(tǒng)（德國(guó)，Leica，型號(hào)THUNDER Imager Tissue）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 干預(yù)方法：針刺組于SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠出生30 d后開(kāi)始，依照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［3］標(biāo)準(zhǔn)選取天樞穴（ST25）及足三里穴（ST36）。天樞穴位于小鼠前正中線旁開(kāi)5 mm，恥骨聯(lián)合以上20 mm 處。足三里穴位于膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下3.5 mm 處。采用0.25 mm×13 mm 不銹鋼針灸針，直刺2 mm，接通電針儀（1m A，2Hz），每周針刺2次，每次20 min，連續(xù)治療13周。針刺治療在氣體麻醉下進(jìn)行（氧氣和一氧化二氮的混合物，3%用于誘導(dǎo)，1.5%用于維持），以減少電刺激的壓力。利魯唑組將利魯唑溶于雙蒸水中，按照30 mg／（kg·d）的劑量［4］，從小鼠90 d日齡開(kāi)始予以小鼠灌胃治療，1次／d。正常組、模型組正常飼養(yǎng)。

2.2 動(dòng)物體征觀察：對(duì)比針刺及藥物利魯唑干預(yù)后SOD1G93A小鼠毛發(fā)光澤度、行走動(dòng)作、肢體震顫、精神狀態(tài)及體質(zhì)量等指標(biāo)。

3 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（Rotarod test） 于小鼠日齡30 d后開(kāi)始，主要用于評(píng)定小鼠協(xié)調(diào)性及肌力。實(shí)驗(yàn)前5 d對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，正式實(shí)驗(yàn)從第6天開(kāi)始。每只小鼠每天重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次間隔15 min，每周測(cè)試2次。記錄小鼠每次轉(zhuǎn)棒時(shí)間，并計(jì)算1 d中3次的平均時(shí)間。轉(zhuǎn)棒儀轉(zhuǎn)速為15 r／min，超過(guò)200 s按照200 s記錄，不足200 s則按照實(shí)際時(shí)長(zhǎng)記錄。

4 組織取材與制備 小鼠療程結(jié)束并完成轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測(cè)試后，進(jìn)行異氟烷氣體麻醉。麻醉后打開(kāi)胸腔，暴露心臟，用頓頭注射器針頭插入心尖，快速滴入0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行全身灌流并剪開(kāi)右心耳，直至肺及肝臟顏色變白為止。迅速斷頭取腦，并取脊髓腰4-5節(jié)段，將取出的組織置于4%多聚甲醛溶液，并在4℃冰箱固定24 h。再用30%蔗糖脫水，48 h 后用OCT 冰凍包埋劑固定，以備冰凍切片。冠狀切片，腦組織切片厚度為14μm，脊髓切片厚度為20μm 保存于-80℃冰箱用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

5 免疫組化檢測(cè) 腦干區(qū)及脊髓IBA-1 和TNF-α表達(dá)：取出冰凍切片37℃復(fù)溫1 h。0.1mol／L PBS室溫沖洗并進(jìn)行抗原修復(fù)。與3%過(guò)氧化氫反應(yīng)15 min，5%BSA 室溫封閉1h，分別滴加1∶300一抗（兔抗IBA-1 與TNF-α），4℃孵育過(guò)夜。次日，0.1 mol／L PBS沖洗后二抗室溫孵育1 h，再進(jìn)行PBS沖洗，滴加SABC反應(yīng)1 h，沖洗后DAB顯色10 min，蘇木素復(fù)染1.5 min，最后常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠體征變化 小鼠60 d日齡時(shí)，各組間小鼠毛發(fā)、行動(dòng)、精神狀態(tài)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），體征狀態(tài)良好。小鼠120 d日齡時(shí)，對(duì)照組毛發(fā)光澤、體重正常、行動(dòng)靈活、精神狀態(tài)良好。模型組小鼠毛發(fā)干枯，精神不振，出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)后肢震顫或無(wú)力，肌肉明顯萎縮，行走呈拖拽狀，體重明顯下降（P＜0.05）。針刺組各狀況較模型組均有好轉(zhuǎn)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠18周體重比較（g）

2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 小鼠在轉(zhuǎn)棒儀器上停留時(shí)間稱為潛伏期。停留期長(zhǎng)短可以評(píng)估各組小鼠協(xié)調(diào)能力和肌力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，17周后，模型組、針刺組及利魯唑組較正常組潛伏期均縮短（P＜0.05），但針刺組較模型組、利魯唑組停留時(shí)間長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)功能得到改善。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)潛伏期比較（s）

3 各組小鼠腦干區(qū)IBA-1表達(dá)比較 我們比較了各組小鼠腦干區(qū)IBA-1 表達(dá)情況。結(jié)果顯示，G93A 模型組的小鼠較同窩野生小鼠對(duì)照組比較，IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多，灰度值下降（P ＜0.05），說(shuō)明發(fā)病后的小鼠腦干中小膠質(zhì)細(xì)胞活躍。針刺治療后，IBA-1陽(yáng)性細(xì)胞較模型組明顯減少，灰度值上升（P＜0.05），表明早期針刺天樞穴（ST25）及足三里穴（ST36）可以降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少神經(jīng)元損傷。同時(shí)，利魯唑組也有改善，但與模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 IBA-1在小鼠腦干中的表達(dá)（×20）

4 各組小鼠脊髓IBA-1 和TNF-α表達(dá)比較IBA-1和TNF-α陽(yáng)性產(chǎn)物在小鼠脊髓均有表達(dá)，著色呈棕黃色。與對(duì)照組比較，模型組小鼠脊髓IBA-1和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增高，平均灰度值降低（均P＜0.05），表明SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致了神經(jīng)元的損傷。電針治療后脊髓IBA-1和TNF-α陽(yáng)性表達(dá)下降，平均灰度值增高（均P＜0.05），表明針刺后有可能通過(guò)抑制促炎因子TNF-α的釋放，降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而保護(hù)神經(jīng)元，進(jìn)而改善了SOD1G93A小鼠疾病的發(fā)展。利魯唑組IBA-1和TNF-α陽(yáng)性表達(dá)雖有所下降，但與模型組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2、圖3）。

圖2 IBA-1在小鼠脊髓中的表達(dá)（×20）

討 論

肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷疾病，具有選擇性地累及脊髓前角細(xì)胞、腦干顱神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核等特點(diǎn)。該病癥狀主要表現(xiàn)為球部、四肢、軀干、胸部、腹部的肌肉逐漸無(wú)力和萎縮，最終多數(shù)由于呼吸麻痹致死。該發(fā)病率1／10萬(wàn)～3／10萬(wàn)，年患病率為5.2／10萬(wàn)，年死亡率為1／10萬(wàn)，且呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)［5］。并且我國(guó)發(fā)病率早于歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家，為49.8～54.3歲［6］。ALS具有起病隱襲，致殘率和死亡率高的特點(diǎn)。根據(jù)病因?qū)⒃摬》譃榧易逍裕‵ALS）和散發(fā)型（SALS）兩個(gè)臨床類型。其中遺傳型約占5%～10%，平均發(fā)病年齡為58-63歲；散發(fā)性約占90%～95%，平均發(fā)病年齡為43-52歲。臨床又將該病分為經(jīng)典型ALS肢體起病型、經(jīng)典型ALS 延髓起病型、連枷臂綜合征（Flail arm syndrome，F(xiàn)AS）、連枷腿綜合征（Flail leg syndrome，F(xiàn)LS）、原發(fā)性側(cè)索硬化（primary lateral sclerosis，PLS）、進(jìn)行性肌萎縮（progressive muscular atrophy，PMA）。ALS 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，這些機(jī)制可能存在于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中。通常，在腦和脊髓損傷、感染、毒素的刺激下或在自身免疫的作用下會(huì)出現(xiàn)由膠質(zhì)細(xì)胞激活的免疫應(yīng)答即神經(jīng)炎癥。瞬時(shí)神經(jīng)炎癥損傷后組織修復(fù)期間起到保護(hù)作用，但慢性神經(jīng)炎癥與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性疾病如帕金森、阿爾茲海默癥、ALS 等病理機(jī)制均有關(guān)。病理性神經(jīng)炎癥主要由于激活的膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。同時(shí)有研究證明在炎癥因子如腫瘤壞死因子的溶液中也發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的存在［7］。

ALS被世界衛(wèi)生組織列為世界五大疑難雜癥之一。目前利魯唑用于治療ALS是美國(guó)FDA 唯一批準(zhǔn)的治療藥物。利魯唑是一種谷氨酸拮抗劑，通過(guò)抑制NMDA 受體和AMPA 受體的興奮性突觸后效應(yīng)，減少谷氨酸釋放，抑制持續(xù)鈉電流及神經(jīng)元重復(fù)放電，從而降低神經(jīng)元的興奮性［8］。有臨床研究表明［9］，利魯唑主要可以延長(zhǎng)ALS患者最后階段的生存期，從而延長(zhǎng)壽命。

由于利魯唑價(jià)格昂貴，因此急需尋找一種新的治療手段，而針灸在治療退行性神經(jīng)元損傷方面有良好的作用［10］。同時(shí)，針灸在疾病治療中的抗炎作用被廣泛應(yīng)用，并且電針刺激可以通過(guò)減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡和改善動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能從而治療神經(jīng)退行性疾病，這已經(jīng)得到證實(shí)［11］。根據(jù)ALS 的臨床癥狀，本病當(dāng)屬中醫(yī)痿證范疇［12］。其病因病機(jī)可歸納為先天不足或后天失養(yǎng)導(dǎo)致脾失健運(yùn)、肝腎虧虛，氣血生化不足。《素問(wèn)·痿論》曰：“陽(yáng)明者，五臟六腑之海，主潤(rùn)宗筋，宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也”。由此看出，調(diào)理脾胃，氣血充足，則筋脈濡養(yǎng)，束骨而利關(guān)節(jié)也。許多醫(yī)家通過(guò)整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［13］治療ALS 應(yīng)用最多的經(jīng)脈就是足陽(yáng)明胃經(jīng)，這與“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”治療原則一致。本實(shí)驗(yàn)選擇電針刺激SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠足陽(yáng)明胃經(jīng)天樞穴（ST25）及足三里穴（ST36）。天樞穴不但是胃經(jīng)的要穴，同時(shí)還是大腸經(jīng)的募穴，它是陽(yáng)明經(jīng)脈氣生發(fā)之地；足三里穴為足陽(yáng)明經(jīng)的下合穴，是六腑氣血深注于下肢三陽(yáng)經(jīng)的部位，為生化之源，氣血充盈。因此，本研究在小鼠30 d時(shí)予以電針刺激天樞穴及足三里穴，以促進(jìn)胃中腐熟生化水谷精微，濡養(yǎng)宗筋，陽(yáng)明充則宗筋潤(rùn)，而能束骨利機(jī)關(guān)，從而延緩ALS疾病的進(jìn)展，這可能也是針刺療法干預(yù)ALS早期的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比針刺組與利魯唑治療組，結(jié)果顯示兩組均有效改善了小鼠運(yùn)動(dòng)功能及生存質(zhì)量。再通過(guò)對(duì)各組小鼠腦干區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物IBA-1的觀察發(fā)現(xiàn)，ALS模型小鼠腦干區(qū)IBA-1較正常組小鼠顯著增加，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］，這些激活的小膠質(zhì)細(xì)胞加快神經(jīng)元活化最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)針刺治療腦干區(qū)IBA-1表達(dá)顯著減少。為了進(jìn)一步探究針刺治療機(jī)制是否與抑制炎癥因子釋放有關(guān)，我們檢測(cè)了各組小鼠脊髓前角炎癥因子IBA-1和TNF-α的表達(dá)。TNF-α信號(hào)已被證明［15］在神經(jīng)中樞系統(tǒng)內(nèi)可以通過(guò)激活膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示通過(guò)針刺刺激干預(yù)小鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化參與炎性反應(yīng)有一定抑制作用。但同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，雖然利魯唑有效改善了小鼠生存質(zhì)量，且在腦干及脊髓IBA-1和TNF-α的陽(yáng)性表達(dá)有所下降，但與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利魯唑在最后階段雖然改善了小鼠生存質(zhì)量，但其作用機(jī)制可能與減少神經(jīng)炎癥關(guān)系并不密切。另外，該結(jié)果與利魯唑給藥時(shí)間是否有關(guān)，仍需我們?cè)诮窈笱芯恐欣^續(xù)探索。同時(shí)，再次證明早期針刺治療可能與減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

近年來(lái)，ALS的發(fā)病率逐年上升，目前手段非常有限［16-17］。隨著研究更加深入，針刺療法良性調(diào)節(jié)，價(jià)格低廉及無(wú)副作用等，被廣泛應(yīng)用［18-20］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，針刺治療在SOD1G93A模型小鼠中通過(guò)抑制活化的膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子，從而發(fā)揮了一定抗炎的作用，減少了神經(jīng)元在腦和脊髓的損傷。然而，為了更加充分了解針灸治療作用機(jī)制，我們還需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定針刺治療是否會(huì)改變氧化應(yīng)激、蛋白聚集和線粒體功能障礙等，從而為臨床治療提供更多新思路。