剛地弓形蟲VEG株速殖子感染宿主細胞最優(yōu)接種比的曲線擬合分析

郭海婷，譚 潔，夏春波，榮翠平，鄒珍友，李中原,2

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的機會致病性原蟲，專性有核細胞內寄生，能夠感染包括人類在內的所有恒溫動物，對人體健康、公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產均危害嚴重[1-2]。值得注意的是，弓形蟲分布極其廣泛，擁有速殖子、緩殖子和卵囊等多種感染形態(tài)，能夠突破血-腦和血-胎屏障造成人和動物感染，但作用機制至今尚不清楚，是深入研究病原微生物觸發(fā)生命體行為異常和解析先天性感染幸存胎兒智力發(fā)育不全作用機理的重要模式生物[3-5]。作為毒株傳代、制備突變株、開展預實驗和驗證實驗結果的中心環(huán)節(jié)，體外培養(yǎng)對探明弓形蟲速殖子毒力基因功能及其致病機制都至關重要[6]。據(jù)報道，以24孔細胞板對弓形蟲RH株速殖子進行體外培養(yǎng)時，蟲體感染量與宿主細胞起初鋪入數(shù)間緊密相關[7]，至于弓形蟲其他毒株或培養(yǎng)類型，目前尚無報道。因此，本文以非洲綠猴腎細胞(即Vero細胞)為研究對象，運用96孔、24孔、12孔、6孔細胞板和25T培養(yǎng)瓶對弓形蟲VEG株速殖子進行體外培養(yǎng)，經Real-time PCR定量和曲線擬合分析，旨在探討不同感染梯度的弓形蟲速殖子對宿主細胞侵蝕能力強弱的影響及二者間存在的接種比例關系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1弓形蟲毒株與細胞系 弓形蟲VEG蟲株(Genotype III)受中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室朱興全研究員惠贈，宿主Vero細胞系由廣西腦與認知神經科學重點實驗室傳代保存。

1.1.2主要儀器、耗材和試劑 MX3005P型Real-time PCR熒光定量基因擴增儀購自德國Agilent公司；96孔、24孔、12孔、6孔細胞培養(yǎng)板(平底)和25T細胞培養(yǎng)瓶(斜頸，矩形)為Thermo Fisher Scientific公司產品；TIANamp Genomic DNA Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；Real-time PCR EasyTM SYBR Green I為福際生物技術(成都)有限公司產品。

1.2 方 法

1.2.1細胞培養(yǎng) 待傳代的宿主Vero細胞系經0.25%胰酶消化和血細胞計數(shù)板精確計數(shù)后，用10% FBS/DMEM培養(yǎng)液稀釋至1.0×105個/mL，按照每孔0.1 mL、0.5 mL、1.2 mL和2.5 mL的上液量分別鋪入96孔、24孔、12孔和6孔細胞培養(yǎng)板；將所得細胞稀釋至1.74×105個/mL，移取4.5 mL鋪入25T培養(yǎng)瓶內，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，備用。

常規(guī)培養(yǎng)并收集弓形蟲VEG株速殖子，經破碎、純化和計數(shù)后用10% FBS/DMEM培養(yǎng)基稀釋至1.0×105個/mL并倍比稀釋出7個濃度梯度，依次加入上述96孔(0.1 mL/孔)和24孔(0.5 mL/孔)細胞培養(yǎng)板中；將所得速殖子分別稀釋至1.5×105個/mL、5.0×105個/mL和1.56×106個/mL，并作同上倍比稀釋，按0.8 mL/孔、0.5 mL/孔或0.5 mL/瓶的感染劑量依次加入上述12孔、6孔細胞板或25T培養(yǎng)瓶中，以使首孔/首瓶內宿主細胞鋪入數(shù)與弓形蟲感染數(shù)相同；于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內連續(xù)培養(yǎng)4 d，實驗重復3次。

1.2.2樣品收集與DNA提取 待培養(yǎng)結束，運用移液器槍頭或細胞刮刮凈并全量收集96孔、24孔細胞板內培養(yǎng)物，其他細胞板和培養(yǎng)瓶內所得物經充分吹打混勻和測定總體積后各取0.5 mL，分別用于基因組提取，具體操作方法依照天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Genomic DNA Kit使用說明進行(洗脫體積均為50 μL)。

1.2.3Real-time PCR定量檢測 精確計數(shù)弓形蟲VEG株速殖子8.3×106個，同上提取基因組并10倍稀釋出6個濃度梯度，用來繪制所需的標準曲線。依據(jù)文獻[8]，合成一對用來定量分析待檢樣品中弓形蟲VEG株速殖子數(shù)目的特異性引物(即上游：5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′；下游：5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)，經Real-time PCR定量擴增，分別計算出感染4 d時各細胞板和培養(yǎng)瓶內的蟲體數(shù)。

2 結 果

2.1弓形蟲VEG株速殖子數(shù) 參照文獻[8]，合成一對特異性引物(預期擴增片段大小為121 bp)，經Real-time PCR定量檢測來系統(tǒng)評價不同感染梯度的弓形蟲VEG株速殖子作用4 d時對侵蝕宿主Vero細胞能力的影響，所得結果如表1所示。不難發(fā)現(xiàn)，弓形蟲速殖子對宿主細胞侵蝕能力的強弱程度與其感染量和所用耗材規(guī)格間關系密切，即速殖子感染量及所用耗材對弓形蟲侵蝕宿主細胞的能力均影響明顯。

表1 弓形蟲VEG株接入宿主細胞4 d時各培養(yǎng)孔/瓶內的速殖子數(shù)目Tab.1 Number of parasites in the well or bottle at 4 d post-infection with T. gondii VEG strain

2.2曲線擬合與回歸趨勢分析 假設自變量x[即LOG(VEG速殖子感染數(shù)/宿主細胞數(shù)，2)]與因變量y[即培養(yǎng)4 d時各細胞板和培養(yǎng)瓶內VEG速殖子數(shù)]之間有回歸關系，本文依照最小二乘法基本原理[9-10]，運用多項式函數(shù)(二次、三次和四次)、線性函數(shù)、指數(shù)函數(shù)以及生長曲線(Pearl model和Gompertz model)等7種常見曲線回歸模型對弓形蟲VEG株速殖子感染宿主Vero細胞4 d時的蟲體平均數(shù)進行擬合分析，并分別求解殘差平方和Q值、決定系數(shù)R2和F值。結果顯示，擬合四次多項式時所得Q值最小，且決定系數(shù)R2、F值最大(圖1)，表明四次多項式為弓形蟲速殖子感染宿主細胞4 d時的最佳擬合曲線方程，其回歸趨勢如圖2所示。

Note: * indicates that the regression trend for the fitting curve is inconsistent with the expected results.圖1 7種常見回歸曲線的擬合度分析Fig.1 Fitting degree analyses for the seven common models of regression curves

A: Quantitative analysis curve for the Real-time PCR; B-F: The numbers of VEG parasites at 4 d post-infection and their regression curves for 96-, 24-, 12-, 6-well plates and 25 T bottles, respectively (n=3).圖2 Real-time PCR標準曲線與最佳擬合函數(shù)方程的回歸趨勢分析Fig.2 Standard curves for Real-time PCR and the regression trend analyses for the best model

2.3參數(shù)統(tǒng)計與建議接種比 運用Excel工具和SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，分別對感染4 d時96孔、24孔、12孔、6孔細胞板和25T培養(yǎng)瓶中VEG速殖子所得最佳回歸函數(shù)方程的擬合系數(shù)進行求解，結果如表2所示。

通過對所有四次多項式函數(shù)求二階導數(shù)和令其為0，分別解得：96孔板，x1=-7.90，x2=-2.85；24孔板，x1=-6.34，x2=-2.41；12孔板，x1=-5.99，x2=-2.18；6孔板，x1=-5.93，x2=-2.01；25T培養(yǎng)瓶，x1=-5.43，x2=11.48，故96孔、24孔、12孔、6孔細胞板和25T培養(yǎng)瓶作用4 d時VEG速殖子感染數(shù)與宿主細胞數(shù)間建議接種比依次為2-7.90(舍棄)或2-2.85，2-6.34(舍棄)或2-2.41，2-5.99(舍棄)或2-2.18，2-5.93(舍棄)或2-2.01，2-5.43或211.48(舍棄)，即1/7.20，1/5.32，1/4.53，1/4.03和1/43.02(表2)。

3 討 論

作為一種重要的人獸共患性原蟲，剛地弓形蟲已經成為探討病原微生物導致機體發(fā)病如人和動物行為異常、幸存胎兒智力發(fā)育不全及其作用機制的主要模式生物[5,11]。加之，體外培養(yǎng)弓形蟲是獲取速殖子、產生目的基因缺失株及其補充株、進行預實驗和所得結論驗證的重要途徑，對闡明弓形蟲引起機體發(fā)病及其分子機制的作用不容忽視[12-13]。因此，研究弓形蟲速殖子感染量與宿主細胞起初鋪入數(shù)間的接種比例具有實用價值。前期研究結果顯示，采用24孔細胞板對弓形蟲RH株速殖子進行體外培養(yǎng)時，后者感染量與宿主Vero細胞鋪入數(shù)之間存在接種比例關系[7]，對于其他蟲株或培養(yǎng)類型，至今沒有報道。因此，本研究繼續(xù)以Vero細胞為實驗對象，分別用96孔、24孔、12孔、6孔細胞板和25T培養(yǎng)瓶對VEG株速殖子進行體外培養(yǎng)，保證宿主細胞鋪入密度及首個速殖子感染濃度與細胞起初鋪入數(shù)相同的情況下作用4 d，經Real-time PCR定量，以7種常見曲線回歸模型對所得速殖子數(shù)目的平均值進行擬合分析，明確所用耗材規(guī)格與弓形蟲速殖子起初感染量對侵蝕宿主細胞能力影響的同時，探討存在二者之間的接種比例關系。

表2 細胞培養(yǎng)板/瓶內速殖子最佳回歸曲線的參數(shù)統(tǒng)計與建議接種比Tab.2 Parameters of the best regression curves and the inoculation ratios for T. gondii in plate or bottle

Real-time PCR定量檢測結果顯示，弓形蟲VEG株速殖子起初感染量與所用耗材規(guī)格均對弓形蟲入侵宿主細胞的能力影響明顯，提示同種耗材培養(yǎng)條件下，蟲體感染量與宿主細胞鋪入數(shù)間關系緊密。經曲線擬合進一步分析發(fā)現(xiàn)，四次多項式是弓形蟲感染宿主細胞4 d時的最適回歸曲線方程，且所得速殖子無法擬合冪和對數(shù)兩種函數(shù)類型，與我們前期研究結果相一致[7]。通過對所得四次多項式求導和求極值認為，運用同種耗材對弓形蟲速殖子及其宿主細胞進行體外共培養(yǎng)時，二者之間存在最優(yōu)接種比例關系，即96孔、24孔、12孔、6孔細胞板和25T培養(yǎng)瓶依次為1/7.20、1/5.32、1/4.53、1/4.03和1/43.02。綜上所述，所用耗材的培養(yǎng)規(guī)格是造成各組間最優(yōu)接種比差異明顯的關鍵因素，所得結果可為日后深入研究弓形蟲速殖子與宿主細胞間及二者與所用耗材規(guī)格間互相作用關系提供重要實驗室參考依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：郭海婷，譚潔，夏春波，等.剛地弓形蟲VEG株速殖子感染宿主細胞最優(yōu)接種比的曲線擬合分析[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：105-109. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.020