海南省類鼻疽伯克霍爾德菌的分子流行病學特征分析

朱 雄，陳 海，李 沙，王立程，吳多榮，王旭明，陳如壽，鄭 霄，劉志國，

類鼻疽病(Melioidosis)是由類鼻疽伯克霍爾德菌所致的人獸共患傳染病[1]。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種氧化酶和觸酶陽性，不形成芽胞、無異染顆粒，有1-4根端鞭毛而運動的非發酵革蘭陰性桿菌[2]。類鼻疽伯克霍爾德菌主要棲息于熱帶地區的土壤、水體和稻田中[3]。在東南亞和澳大利亞北部等地區廣泛分布。破損的皮膚、消化道和呼吸道等途徑均可感染。人和動物因接觸污染的土壤或水而感染。類鼻疽無典型的臨床表現，又稱“類百病”。急性期常表現為肺部感染相關病癥，慢性期則多為受累器官組織的化膿性表現。病情通常較重，若不及時診治，病死率較高。目前，該病已成為熱帶和亞熱帶地區人群的主要公共衛生問題[4]。

我國自1991年首次在廣東湛江報告4例病人以來，陸續在福建、廣西、海南等地報道了相關病例[5-6]。同時，從廣東、廣西和海南等地的水樣、患者血樣中分離出類鼻疽病原菌[7]。當前，海南正值全力打造國際旅游島和構建全球健康管理中心，商業往來和出入境旅游日益頻繁。對海南地區傳染病防控提出了新的要求，特別是類鼻疽的檢測防控將面臨極為嚴峻的形勢。然而，全面的針對該地區類鼻疽的分子流行病學相關研究鮮有報道。MLVA_4實驗方法是一種分辨力極好的類鼻疽分型方法，能較好的區分菌株間的分子流行病學相關性[8]。本研究采用該方法對海南地區近年分離的菌株進行分析，調查類鼻疽疫情的流行特征。不僅對海南類鼻疽的防控具有確切的流行病學意義，而且對我國南方地區的類鼻疽監測、診療和防控具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1主要儀器 ClassⅡ A2型生物安全柜、BACTEC FX全自動血培養儀和BD Phoenix 100自動細菌鑒定儀(美國BD公司)， GeneAmp梯度PCR儀(Applied Biosystems Inc，USA)，DYY-6C-電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Gel Doc XR自動凝膠成像系統(Bio-Rad，USA)。

1.1.2試劑 2×EasyTaq PCR Super mix、DNA Marker 2000 (TranS2K)由北京全式金生物技術有限公司提供。細菌DNA提取試劑盒購自德國凱杰[Qiagen]。MLVA_4引物名稱、序列及擴增片段見文獻[9]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3病例資料及菌株來源 164名患者的性別、年齡、職業及癥狀、治療結局等相關病案資料來自各醫院的住院患者信息管理系統,該類信息被各醫院科研中心批準使用并嚴格遵守了醫院的相關規定,并用Excel 2016對相關病例資料進行整理和分析。164株類鼻疽伯克霍爾德菌全部來自患者的臨床樣本，其中2株來自尿液，10株來自臨床分泌物，22株來自痰液，24株來自膿液，106株來自血液樣本。病原的分離、鑒定作為患者的主要診斷依據。

1.2 方 法

1.2.1菌株的分離鑒定 在無菌條件下取患者的血液或體液(分泌物、膿液等)樣本5～10 mL，在生物安全柜中接種于全自動細菌鑒定培養瓶中，做好標記進行培養。待出現陽性信號后，將1 mL可疑標本轉種于血平板培養基進行純化，并根據菌落形態等特征做出初步判定；并用革蘭氏染色和全自動生化鑒定系統對可疑菌株進行鑒定。全部實驗均在各醫院檢驗科的生物安全二級實驗室的生物安全柜中進行。此外，分離菌株的保存和使用嚴格遵守實驗室的生物安全相關規定。

1.2.2菌株的DNA提取 菌株的DNA提取嚴格遵照凱杰[Qiagen]細菌DNA提取試劑盒的操作步驟進行，制備好的DNA -20 ℃保存、備用。

1.2.3MLV_4實驗具體實驗方案 參照文獻[8]。采用20 μL擴增體系,上下游引物各0.4 μL(10 μmol /L)，模板DNA 1.0 μL, MIX18.2 μL。擴增參數為：預變性 95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s, 退火68 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，33個循環，終末延伸72 ℃, 5 min，5 μL擴增產物加入1.5%的瓊脂糖凝膠孔中經110 V電泳40 min在凝膠成像下觀察結果。將預期擴增送生物公司測序。

1.2.4MLV_4數據分析 根據 GeneScan5.0 LIZDNA Marker (美國 ABI公司)確定擴增產物長度，并將產物長度轉換為各VNTR位點的重復數，從而獲得每個菌株的MLVA_4特征值。同時，將菌株的背景資料(分離地點、時間和宿主)一同錄入Excel，保存為制表符分隔用于聚類分析。將菌株的MLVA特征值導入Bionumerics7.6軟件，采用非加權類平均法(UPGMA)進行聚類，構建實驗菌株的親緣關系樹圖和最小生成樹(Minimum Spanning Tree)。

1.2.5類鼻疽病例的臨床特征分析 用Excel 2016將2006-2012年收集的164例類鼻疽患者的性別、職業、臨床診斷及治療結果進行統計，并采用描述性統計的方法對上述病例的臨床特征進行分析。

2 結 果

2.1菌株的分離鑒定 菌落在血平板生長良好，24 h～48 h可形成圓形中央微隆起的灰白色菌落，菌落呈粗糙輪盤狀，有較強的金屬質感和土霉味。革蘭染色陰性，呈兩端偏濃染的桿菌。見圖1。

圖1 類鼻疽伯克霍爾德菌的形態特征(左圖)和革蘭氏染色特征(右圖)Fig.1 Morphological feature (left) and Gram stain (right) characteristics of B. pseudomallei isolates

2.2菌株的地區分布 164株類鼻疽伯克霍爾德菌分布于海南省的17個縣(市/區)，其中三亞市菌株最多(39株)，其次為東方市(19)、儋州(15)、樂東(14)、萬寧市(14)、文昌(10)。其他地區菌株較少，而屯昌縣、臨高縣、瓊中黎苗族自治縣和五指山市無菌株。菌株主要分布在海南省西南部沿海市(縣/區)，東北部市(縣/區)菌株分布較少。中部3個地區無菌株分布。見圖2。

圖2 海南省類鼻疽伯克霍爾德菌的地區分布Fig.2 Areas distribution of B. pseudomallei strains in Hainan Province

2.3遺傳多態性分析 MLVA_4方法對菌株的分辨力指數為0.989 5。4個位點的多態性指數由高到低依次為0.901 1(VNTR3)，0.842 1(VNTR1)，0.819 8(VNTR2)和0.815 9(VNTR4)。4個多態性位點的等位基因型別依次為11，9，15和14。4個位點的HGDI指數均高于0.8，其中VNTR3有15個不同的等位基因型別。見表1。

表1 MVLA_4方法中4個位點的多態性指數及等位基因型特征Tab.1 Diversity index and allele characteristics of 4 loci in MVLA_4 approach

2.4菌株的聚類分析 164株類鼻疽聚為97個基因型(GT1～97)，其中33個為共享基因型(圖3)，另外64個為單一基因型，每株菌代表一個基因型。33個共享基因型包括100株類鼻疽菌，菌株聚類率為61.0%(100/164)，每個共享基因型分別由2-8株組成，其中13個共享基因型(GT2、3、4、5、6、28、30、43、53、58、67、82、93(陰影覆蓋基因型))由來自相同地區分離的菌株構成；28個共享基因型(除GT3、5、30、43和53外其他所有共享基因型)分別由2～5個不同地區的菌株構成。此外，32個共享基因型(GT65除外)的菌株分別由相同ST型的菌株構成。見圖3。

2.5菌株的最小生成樹(MST)分析 164株類鼻疽伯克霍爾德菌可分為2個地理集群(Ⅰ和Ⅱ)。2012年在安定縣分離的2株類鼻疽伯克霍爾德菌分別位于2個類群的基部節點，并與來自文昌、樂東、澄邁和萬寧地區的菌株密切相關。內蒙古患者分離的菌株與三亞、海口、東方、萬寧及樂東地區的菌株具有完全相同的MLVA_4基因型。福建患者分離的2株菌分別位于2個不同的集群，其中HNBP059與昌江地區的菌株有完全相同的MLVA_4基因型，HNBP004與東方和萬寧的有完全相同的MLVA_4基因型。俄羅斯患者分離的菌株與定安縣的菌株僅有單位點差異。湖南省患者分離的菌株與三亞和陵水地區的菌株存在位點差異。見圖4。

2.6病例的年齡分布特征 在164名患者中，男性138例，占比84%，女性26例。男女比例為5.3∶1。164名患者的平均年齡為48.5歲。50歲年齡組分布最多，構成比為70%(42/60)，其次為40歲(34)，30歲(28)和60歲(25)年齡組，其余年齡組患者較少，見圖5。

圖4 164株類鼻疽伯克霍爾德菌的最小生成樹Fig.4 MST of 164 B. pseudomallei strains in Hainan province

圖5 164例類鼻疽患者的年齡分布Fig.5 Ages distribution in 164 cases of Melioidosis

圖3 164株類鼻疽伯克霍爾德菌的親緣關系樹圖
Fig.3 Phylogenetic tree of 164B.pseudomalleistrains in Hainan province

2.7患者的職業分布 患者來自12種不同的職業，其中農民患者最多，占比81.7%(134/164)；工人7名，占比4.3%(7/164)。另有保安、記者和公務員等。見表2。

2.8患者的臨床感染特征分析 164個病例涉及16個不同的臨床感染特征譜，其中肺部受侵病例最多(64)，占比39%(64/164)，其次為敗血癥(48)，占比29.3%。另有膿毒血癥、腎臟疾患、發熱待查等10余種不同的病變特征。見圖6。

2.9患者的治療結果 在164例類鼻疽患者中有57例治愈，占比34.8%。65例好轉，占比39.6%，15例未愈，占比9.1%。死亡18例，死亡率11%。未好轉7例，未知2例。見表3。

表2 164例類鼻疽患者的職業分布Tab.2 Occupational distribution of 164 Melioidosis patients

圖6 164例類鼻疽患者的臨床感染特征Fig.6 Clinical infection characteristic in 164 patients of Melioidosis

表3 164例類鼻疽患者的治療結果Tab.3 Therapy outcome in 164 patients of Melioidosis

3 討 論

對海南地區類鼻疽伯克霍爾德菌的分子流行病學關聯及患者的臨床特征進行調查分析，不僅對深入了解該地區類鼻疽的流行規律及指導臨床診療具有一定意義，而且對指導我國南方地區開展類鼻疽防控檢測具有流行病學意義[6]。類鼻疽無經典的臨床表現，病原分離是類鼻疽確診的金標準[10]。類鼻疽形態特征較為特殊，在血平板培養48 h可形成中央微隆起的灰白色粗糙樣輪盤狀菌落，并有較強的金屬質感和土霉味，可作為臨床實驗室鑒別該菌的特征。本研究共計從海南省的17個縣(市、區)患者分離獲得164株類鼻疽伯克霍爾德菌，菌株分布范圍較廣。菌株主要分布于海南省西南部的沿海地區，而北部地區分布較少，特別是中部3個縣(市、區)無菌株分布。菌株的分布特征不僅與類鼻疽的傳染特點相符，類鼻疽通常多見于污水、土壤和稻田中，常因務農等接觸而引發感染[11]，而且與該地區稻田土壤中類鼻疽的分布情況一致。因本研究分離的菌株全部來自就診患者的臨床樣本，并非對患者的主動監測所獲。另外，類鼻疽患者的臨床表現多樣化、而且類鼻疽分離與采樣時期、是否使用抗生素等因素密切相關。因此，感染患者樣本中類鼻疽的確切分離率尚需研究證實。但先前的研究顯示該地區土壤類鼻疽的分離率為10.2%(110/1 080)，菌株分布于海南所有市縣(區)，但菌株的分布數量極不平衡。分離類鼻疽最多的地區為西南部沿海市縣，南部地區土壤中的類鼻疽分離率最高，明顯高于其他地區 (P<0.01)[12]。此外，廣西的土壤和稻田樣本類鼻疽分離率分別為8.4%和9.1%，在一定程度上對估算患者臨床樣本中類鼻疽的分離率提供了參考。海南島南北地區分別為季風熱帶和亞熱帶氣候，島嶼的東部和南部多為臺風的著陸點，而且降雨量和風速較高。臨床和氣候相關研究表明臺風或強降雨與類鼻疽之間有潛在的相關性[13]。此外，土壤類型、地理位置、土壤養分和鹽含量與類鼻疽存在與否有明顯的相關性[14]。因此，沿海地區多種氣候因素構成的特異微環境可能更加適宜類鼻疽的存活和傳播。因此，建議在海南省的南部沿海市縣開展相應的病原監測以及對高危人群進行宣傳教育，從而提升受威脅人群的防病意識，有效阻斷該病的傳播。

基于HGDI指數，MLVA_4對菌株的分辨力為0.989 5，4個分型位點分別有9個以上的等位基因型別，表明試驗菌株有較高的遺傳多態性。在4個位點中VNTR3位點有15個不同的等位基因型，是MLVA_4方法中分辨力最高的位點，提示樣本來源地區的類鼻疽伯克霍爾德菌的該串聯重復序列位點變異度最高，可能反映了樣本來源地區類鼻疽伯克霍爾德菌的微進化特征[15-16]。為了闡述菌株間的分子關聯，我們采用國際公認的MLVA_4分型方法對現場分離的164株類鼻疽伯克霍爾德菌的相關性進行了調查。研究表明該方法不僅對類鼻疽具有較高的分辨力，而且能夠區分無流行病學相關但MLST和PFGE相同克隆群的菌株，當分離株來自確定的點源暴發流行，則菌株聚為相同或極為相似的類群[8]。本研究中164株類鼻疽聚為97個MLVA_4基因型(GT1～97)，其中33個為共享基因型，表明該類基因型的菌株間可能有潛在的流行病學關聯。另外64個為單一基因型且每株菌代表一個獨特的基因型，表明該地區類鼻疽具有零星或散發的流行特征。13個共享基因型由來自相同地區分離的菌株構成，證實了該地區類鼻疽呈現由多個共同傳染源引發的多點暴發流行的特征。另外，有28個共享基因型分別由2～5個不同地區分離的菌株構成，揭示了該地區類鼻疽存在由多個共同傳染源引發的多地交叉感染的流行特征。33個共享基因型包括100株類鼻疽菌，菌株聚類率為61.0%(100/164)，每個共享基因型分別由2-8株組成，而且32個共享基因型的菌株分別由相同ST型的菌株構成，表明該地區61%的類鼻疽病例系由相同克隆群菌株感染引起的多點暴發流行。此外，菌株的聚類率為61.0%，所有共享基因型的菌株多來自2～5個不同地區，提示該地區類鼻疽的流行并非僅限于某一市(縣、區)，而是在海南省多個地區傳播流行。應定期開展相應的監測和干預措施，并納入國家疾病檢測系統，從而加強該病的防控效能。

基于MLVA_4數據的最小生成樹(MST)分析結果表明164株類鼻疽伯克霍爾德菌可分為2個地理集群，安定縣分離的2株類鼻疽伯克霍爾德菌分別位于2個類群的起源處。由此，我們推測該地區的類鼻疽伯克霍爾德菌可能起源于定安縣或由定安縣的菌株克隆群擴散傳播引起。此外，定安縣分離的2株菌呈現不同的MLVA_4基因型，并與文昌、樂東、澄邁和萬寧等毗鄰地區的菌株有較高的遺傳相似性。由此，我們推測來自海南東北部市(縣、區)的菌株是該地區類鼻疽伯克霍爾德菌的潛在祖先，該克隆群菌株由多種因素促成其由北向南擴散，從而導致南部多個沿海市區的流行。東南部沿海地區臺風頻發、氣候獨特，人流商運云集可能是沿海地區類鼻疽高發、頻發的原因。建議將該地區的菌株進行全基因組測序，并與全球范圍的菌株進行比較基因組分析從而更好的理解海南地區類鼻疽的起源進化特征，揭示該地區菌株的歷史起源。內蒙古患者分離的菌株與三亞、海口、東方、萬寧及樂東地區的菌株具有完全相同的MLVA_4基因型，該患者為內蒙古某報社的記者并在三亞地區進行采訪報道活動時感染類鼻疽，提示傳染源可能來自三亞。福建省患者分離的2株菌分別位于2個不同的集群，2個病例的傳染源可能來自上述有相同基因型的地區。福建同屬類鼻疽疫區，應關注類似的病例從而更好的了解該病的流行病學特征。湖南和俄羅斯患者分離的菌株與該地區的菌株存在單位點差異，應開展全基因組測序從而證實感染來源和揭示流行病學關聯。

在164名患者中，男性138例，占比84%。男女比例為5.3∶1。患者的平均年齡為48.5歲。患者涉及12種不同的職業，其中農民患者最多，占比81.7%(134/164)。人群主要通過接觸含有致病菌的污水和土壤，經破損的皮膚或消化道等感染。50～60歲的男性是該地區農村的主要勞動力，與水及土壤接觸頻繁。研究表明免疫力低下的患者易感性高于普通人群[17]。本研究中45.7%(75/164)的患者有糖尿病，表明免疫力低下是感染類鼻疽的潛在風險。在香港地區早期報道的病例中，所有患者均表現為免疫力低下，包括有糖尿病和自身免疫病史[18]。此外，伴有惡性腫瘤及長期中性粒細胞減少的患者有較高的感染風險[19]。建議患有糖尿病或免疫力低下的患者在疫區從事相關工作，應做好相應的防護措施。

164個病例涉及16個不同的臨床感染特征譜，其中肺部受侵病例最多(64)，占比39%(64/164)，其次為敗血癥(48)，占比29.3%，提示類鼻疽主要侵犯肺部和血液系統，導致呼吸道病癥(咳嗽、胸痛、呼吸急促等)和敗血癥等。臨床表現與國內外其他報道吻合，大多數患者表現為菌血癥、肺部感染[20]。另有膿毒血癥、腎臟疾患、發熱待查、膿腫等10余種不同的病變特征。類鼻疽臨床表現各異，提示在疫區遇有該類癥狀的患者應首先排除類鼻疽感染。因類鼻疽可致多個組織器官的病癥，是一種極容易誤診的疾病[21]。及時準確的診斷需結合多方面的結果綜合判定，避免誤診誤治。應在疫區針對高危人群和醫師開展相應的宣傳教育，特別是提升臨床醫師的鑒別該病的能力和意識，更好地提升類鼻疽的防控診療水平。在164例類鼻疽患者中有65例好轉，占比39.6%，57例治愈，占比34.8%，表明該病的治愈率相對較低。死亡18例，死亡率11%，明顯低于先前的報道(20%～40%)，可能與該地區的類鼻疽的診療水平相關。研究表明絕大多數的死亡與抗生素治療不足有關，未治愈病例可能與誤治及延遲治療相關[22]。在臨床治療時應進行體外藥物敏感性試驗，選擇合適的藥物進行足量、足療程的早期治療。類鼻疽不僅有低治愈率和高致死率的特征，而且臨床表現多變，治療療程較長。做好該病的檢測防控存在較大的壓力。因此，本研究在了解流行病學特征的基礎上，明確了菌株的地理分布，闡明了該病的臨床特征和診斷要點，不僅對提升和促進該病的臨床診療具有積極作用，對南方地區的類鼻疽防控具有重要指導意義。

利益沖突：無

引用本文格式：朱雄，陳海，李沙，等.海南省類鼻疽伯克霍爾德菌的分子流行病學特征分析[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：110-117. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.019