1例產后哺乳期腹瀉患者分離單增李斯特菌的生物學特征分析

張敬蕊，劉 力，王怡倩，楊如剛，許彩虹，劉菁菁，葉長蕓

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)廣泛存在于自然環境中，是一種重要的食源性感染致病菌，可導致人和動物李斯特菌病[1]。Lm感染類型主要分為兩大類，一類為侵襲性感染，主要表現為敗血癥、腦膜炎及腦膜腦炎，死亡率較高；老幼、孕婦和免疫力低下的人群易感；圍產期孕婦感染Lm主要表現為流產、早產、以及死胎，胎兒感染后可發生新生兒敗血癥和腦膜炎。第二類為非侵襲性感染，即免疫力正常的健康人群進食了被大量Lm污染的食品后出現發熱性胃腸炎癥狀，這類感染多為自限性，容易被忽視[2]。國內腹瀉病人糞便中檢出Lm的報道很少，高波等[3]在410份腹瀉病人糞便標本中分離到1株Lm。本研究從1例哺乳期患者糞便中分離到1株Lm，報道如下。

1 病 例

患者，28歲，哺乳期女性，嬰兒6個月。發病經過：在進食一個甜瓜和飲用冰箱冷藏的酸奶1 d后，出現腹瀉癥狀，最多時可達6～7次/ d。腹瀉第2 d就診于當地診所，口服黃連素治療，癥狀緩解，腹瀉次數減少，腹瀉2～3次/ d，大便仍為黏液狀。于2018年5月10日就診于我院內科，詢問病人初期情況，考慮急性胃炎，患者無發熱。實驗室檢查：血常規白細胞、中性粒細胞正常、C反應蛋白正常；便常規：黃色稀便，白細胞3～4個/HP，潛血陰性，輪狀病毒和腺病毒檢測陰性。2018年5月15日糞便培養結果為Lm陽性，因患者青霉素過敏，口服紅霉素進行治療。2018年5月23日，患者復查便常規(黃色軟便，未見白細胞和紅細胞，潛血陰性)、便培養(未檢出Lm)。治療后患者未再出現腹瀉癥狀；在此期間嬰兒無腹瀉癥狀。

2 分離培養結果

參照《感染性腹瀉診斷標準 WS271-2007》和《細菌性腹瀉臨床實驗室診斷操作指南WS/T498-2017》[4]和相關文獻[5]分離培養腹瀉相關病原菌。

2.1志賀菌檢測 挑取適量糞便標本分別加入接種于HE培養基和MAC培養基，36 ℃培養18 h，未檢出志賀菌。

2.2沙門菌檢測 挑取適量糞便接種于SBG增菌液，36 ℃培養18 h，轉種于沙門菌顯色平板和HE培養基，36 ℃培養18 h，未檢出沙門菌。

2.3致瀉性大腸桿菌和O157大腸桿菌檢測 將標本接種于EMB、MAC和O157顯色培養基，36 ℃培養18 h，未檢出致瀉性大腸桿菌和O157大腸桿菌。

2.4Lm檢測 挑取適量糞便標本接種于LB1 增菌液中，放入30 ℃培養箱培養18 h，吸取LB1培養物1 mL 加入到 LB2 增菌液中， 30 ℃二次增菌培養18 h；取LB2 培養物轉種于李斯特菌顯色培養基(CHROMagar)，36 ℃培養18 h。顯色培養基上出現藍色、周圍有透明暈環的菌落(圖1)，接種于血平板后生長的菌落光滑濕潤，灰白色，可產生窄小的β-溶血環(圖2)。挑取可疑菌落進行革蘭染色，采用細菌鑒定儀進行鑒定。

圖1 李斯特菌顯色培養基(CHROMagar)上生長菌落Fig.1 Colonies growing on Listeria chromogenic medium (CHROMagar)

圖2 血平板上生長的疑似菌落Fig.2 Suspected colonies growing on blood plate

3 Lm的鑒定

對可疑菌落進行涂片染色，結果為革蘭陽性桿菌。同時將可疑菌落穿刺于半固體培養管進行動力試驗，30 ℃培養箱中24 h，觀察實驗結果為動力陽性，取菌落的純培養物經VITEK- 2 COMPACT30 全自動細菌分析儀鑒定系統鑒定為Lm。實驗采用ATCC19115菌株作為Lm質控菌株。

4 Lm血清型、PFGE分析、MLST分型和毒力基因檢測

4.1使用日本Denka-Seiken公司的血清抗體，按照產品的說明書對分離到的Lm進行血清型檢測，證實該分離株為4b血清型。

4.2參照法國巴斯德研究所Lm多位點序列分型(MLST)數據庫的操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmoono. html)，采用PCR方法，對Lm 7個管家基因(abcZ，blgA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA)的部分片段進行擴增、測序，將獲得的基因序列與MLST數據庫信息進行比對分析，證實分離的Lm菌株為ST145型，屬于家系I的CC2克隆群。

4.3按照CDC PluseNet標準化操作方法，應用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對Lm分析，采用AscI和ApaI對Lm進行酶切，菌株DNA電泳圖像使用BioNumerisc軟件分析，并與中國CDC病原菌識別網中的單增李斯特菌數據庫進行比對，確定Lm分離株為GX6A16.CN0033型。

4.4參照相關文獻[6-7]進行毒力基因檢測，本研究病例分離的Lm攜帶毒力基因plcB、act、hly、iap、prfA、inlA。

5 藥敏試驗

按照2018年CLSI(美國臨床和實驗室標準協會)標準，應用溫州康泰的E-test條，采用E-test方法對Lm分離株進行5種抗生素的藥敏試驗，結果證實其對青霉素、氨芐西林、美羅培南、紅霉素和復方磺胺均敏感。

6 討 論

Lm是一種重要的食源性病原菌，能引起人的侵襲性及非侵襲性感染[8]。Lm能產生溶血素，對人的致病性較強，可引起成人腹瀉，尤其容易導致老年人、孕婦、新生兒和免疫缺陷患者感染發生李斯特菌病[9]。文獻[10]報道健康成年人對Lm具有抵抗性，暴露后僅發生輕度胃腸炎，且具有自限性。Lm 可突破腸道黏膜屏障，進入肝細胞進行繁殖和擴增，并可通過血液系統在體內擴散，能被T淋巴細胞介導的免疫應答反應清除[11]。高波等[3]從410份腹瀉病人便標本中分離到1株Lm，提示Lm可感染人群可引起不可自愈的腹瀉癥狀。本例患者食用甜瓜和冰箱保存的酸奶后發生未能自愈的較嚴重的李斯特菌性腹瀉，可能與感染的Lm菌量、菌株型別以及機體免疫力等有關，因此對于臨床腹瀉患者糞便標本的檢測病原應該包括Lm，避免漏診及不良預后。

我國北京通州、河北、福建以及黑龍江等多個地方在食品中Lm分離株主要為1/2a血清型[12]，不同血清型Lm菌株的致病力有所不同，98%以上人類李斯特菌病主要由1/2a、1/2b、1/2c和4b等血清型引起[13]。李秀娟等[14]報道石家莊地區李斯特菌食源性感染分離的Lm菌株血清型為1/2a型、2b型、1/2c型和4b型，其中1/2a型菌株數量最多。閆鶴等[15]分析河北省91株食源性致病李斯特菌證實主要血清型為1/2a型。大部分人類李斯特菌病由4b血清型Lm菌株引起，腦膜炎病人樣本中4b型Lm菌株的分離率明顯高于一般患者，而且4b血清型Lm感染者的死亡率(26%)顯著高于1/2血清型(1/2a、1/2b和1/2c)菌株感染患者(16%)[16]。本例患者分離的菌株也為4b型，該型菌株在消化道中的耐受力是否更強以及和(或)比其他型別菌株進入宿主細胞的效率更高，有待于進一步研究證實。

Sylvain等[17]對來源于五大洲的300株單增李斯特菌進行基因型分析發現，家系Ⅰ中CC3克隆群是一個世界性分布的流行克隆群。本例患者分離的Lm為ST145型屬于CC2克隆群，ST145型菌株最早在俄羅斯海參崴地區的嚙齒動物和河流淤泥中分離出，且與ST2比較屬于同一克隆復合群[18-19]。甘霖等[20]從云南滇池棲息的候鳥-紅嘴鷗糞便中分離到ST145型Lm菌株，其基因組與本例病人分離的菌株具有高度的同源性，而我國此前尚未有關從食品、環境及病人分離到ST145型Lm的報道，因此由紅嘴鷗等跨國遷徙的候鳥所導致的高致病性Lm傳入我國對人群具有較高的感染風險。

王紅等[2]報道四川省自貢市分離的3株Lm臨床分離菌株為ST8型、ST778型；王艷等[21]對28例臨床病人分離單增李斯特菌分析發現了1/2b血清型的ST87和ST3型菌株為病人感染的優勢菌型；張曉嬡等[22]對北京市49例李斯特菌病人分離的Lm進行了分析，發現優勢菌株為ST8、ST5、ST87型。提示石家莊地區食源性感染的Lm 存在和我國其他地區不同的ST型別。本例患者腹瀉癥狀明顯、持續時間長，是否與ST145型Lm特殊的致病性有關還需進一步研究證實。Lm的致病性與其毒力基因有密切相關性，缺失毒力基因將會導致其致病性消失或下降。本例患者分離的Lm 攜帶6種毒力基因，與2005-2011年(無2009年)石家莊市地區食品中分離Lm菌株一致[14]。

由于缺乏當地同期的食品及鳥類等來源菌株的相關信息，無法對本例患者感染的來源進行追溯。但作為我國首例ST145型菌株引起的感染病例報道，對于監測該型菌株在我國的分布狀況、評價動物輸入性李斯特菌病的感染風險分析及制定有效的防控措施具有重要意義。

李斯特菌病尚未納入我國法定傳染病的范疇，缺乏對于人群感染風險及臨床李斯特菌病發病率的相關數據，已有報道以食源性單增李斯特菌分析為多。近年來各地報道的李斯特菌臨床病例不斷增加，而單增李斯特菌引起的腹瀉患者容易漏診，臨床機構應加強孕婦等高危人群腹瀉患者糞便標本中Lm的檢測，這對于李斯特菌病病人的及時治療和避免不良預后具有重要意義。

利益沖突：無

引用本文格式：張敬蕊，劉力，王怡倩，等.1例產后哺乳期腹瀉患者分離單增李斯特菌的生物學特征分析[J].中國人獸共患病學報，2020，36(2)：169-172. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.021