胞內羧甲基茯苓多糖的發(fā)酵動力學

張佩，陳默，胡國元

(武漢工程大學 環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢，430205)

羧甲基茯苓多糖(carboxymethylpachyman，CMP)是一種將茯苓聚糖的多糖鏈進行羧甲基化修飾后得到的具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3-6]與增強免疫調節(jié)[7-9]等多種生物功能的水溶性多糖[10]。目前獲取羧甲基茯苓多糖的方法多是依據(jù)液固相振蕩半合成法和液固相不振蕩半合成法這兩種化學修飾法制備或對其進行優(yōu)化[11-15]。但是均存在化學藥劑殘留、環(huán)境污染等問題，不適于綠色生產(chǎn)[16-17]。

王海波等在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加羧甲基纖維素制備改性細菌纖維素，用紅外光譜對其表征，結果顯示改性細菌纖維素中存在明顯的羧甲基特征吸收峰[18]。本課題組前期通過向茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加羧甲基纖維素，經(jīng)茯苓發(fā)酵制備出羧甲基茯苓多糖[17，19]。該法成本低、轉化條件溫和、轉化過程綠色自然，并且能夠借助發(fā)酵過程研究進一步放大[20-21]。

采用數(shù)學模型來定量地描述在發(fā)酵過程中的菌體濃度、生成物濃度和底物濃度等主要的代謝指標的變化規(guī)律，例如，Logistic模型[22]、Sigmoid模型[23]、SGompertz模型或DoseResp模型[24]，從而為多糖的發(fā)酵過程的優(yōu)化控制、小罐實驗數(shù)據(jù)的放大提供理論基礎。另外，一個模型的可靠性評價不能只依賴于回歸分析中的相關系數(shù)，即相關系數(shù)越接近1越準，還應該用其他的統(tǒng)計學方法作為模型擬合時的可靠性分析[25]。

在目前的研究中，對于羧甲基茯苓多糖動力學方面尚未有相關文獻報道，本研究以茯苓為發(fā)酵菌株，在添加了1%的羧甲基纖維素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行改性發(fā)酵，對發(fā)酵過程中主要理化指標測定，采用Logistic模型、Sigmoid模型、SGompertz模型以及DoseResp模型對茯苓發(fā)酵過程中菌絲體生長、胞內羧甲基茯苓多糖生成、底物(還原糖)消耗情況進行擬合，并對模型進行可靠性評價，得到最適的擬合模型的方程，從而為羧甲基茯苓多糖進一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茯苓(Poriacocos)Z1，由湖北中醫(yī)藥研究院王克勤研究員惠贈；玉米粉，市售食品，生產(chǎn)于北京密云；麩皮，市售食品，生產(chǎn)于河南鄭州；羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)，取代度為0.7，分析純，山東西亞化學股份有限公司；葡萄糖、濃H2SO4，分析純，國藥集團；KH2PO4、酒石酸鉀鈉、無水乙醇，分析純，天津博迪化工股份有限公司；3，5-二硝基水楊酸，分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設備

BL-220H電子天平，日本SHIMADZU公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；GNP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；MQT-60恒溫搖床，上海旻泉儀器有限公司；PHS-3CpH計，上海理達儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)(g/L)：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20[26]，用于菌種活化；

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3、蛋白胨1、KH2PO40.1、MgSO40.05、CaCl20.008、MnSO40.006、VB10.02、檸檬酸鐵銨0.000 5[27]；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、玉米粉40、麩皮60、(NH4)2SO42、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41、pH 5.5[28]，另外添加CMC 10[17]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將茯苓Z1菌種從斜面挑起1塊至PDA培養(yǎng)基平板中央，置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，作為活化固體菌種；將活化的茯苓固體種的菌絲外緣打孔，使成直徑為0.672 cm小塊，挑起4塊菌種接入到裝有60 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，然后置于27 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)7 d；將茯苓液體種子按6%的接種量轉入到裝有60 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，然后置于27 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)，設3個重復。

1.2.2 檢測方法

每隔1 d測1次指標，每次都在固定時間取樣并按照相應的檢測方法檢測不同時間各個理化指標數(shù)值，每個檢測重復3個平行，求其平均值。以發(fā)酵時間為橫坐標，各個理化指標為縱坐標，利用Origin 8.0軟件繪制各理化指標隨時間的曲線圖。

1.2.2.1 菌絲體生物量的測定

將發(fā)酵液用3層紗布過濾得到菌絲球，并用流水沖洗3次，將收集的菌絲球置于烘至恒重的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿的質量為m1)中于60 ℃烘干，取出置于干燥器中，待冷卻至室溫下稱重得m2，菌絲生物量m=m2-m1。

1.2.2.2 多糖含量的測定

將烘干的茯苓菌絲體研磨成粉末，稱取0.5 g加入100 mL蒸餾水，沸水浴3 h后抽濾、收集濾液，將濾渣分別重復沸水浴2、1 h后合并濾液，60 ℃旋蒸后定容至100 mL。取1 mL用苯酚-硫酸法測定多糖含量[29]。

1.2.2.3 還原糖含量的測定

采用3.5-二硝基水楊酸法測定發(fā)酵液中還原糖的含量[30]。

1.2.2.4 pH的測定

采用pH計測定發(fā)酵液中pH值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗重復3次，采用Origin8.0軟件進行作圖分析，選取合適的模型對茯苓生物量、胞內羧甲基茯苓多糖生成、還原糖的消耗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，并用相關系數(shù)R2、均方誤差(mean square error，MSE)和準確因子(accuracy factor，AF)、偏差因子(Bias factor，BF)作為可靠性評價標準篩選出最合適的模型進行定量描述[31-33]，如公式(1)～公式(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：VO，試驗觀測值；Vp，模型所得出的預測值；n，次數(shù)。

2 結果與分析

2.1 胞內羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程中各理化指標的變化趨勢

由圖1所示，茯苓在0～96 h為快速生長期，隨后進入穩(wěn)定期，168 h后進入衰亡期，發(fā)酵結束。茯苓在0～96 h消耗葡萄糖的速度迅速增加，隨后逐漸降低，在發(fā)酵第168 h時，發(fā)酵液中葡萄糖濃度為4.908 g/L，在第216 h時，發(fā)酵液中殘余的葡萄糖濃度為0.890 5 g/L。茯苓在發(fā)酵時間為0～96 h生長速度迅速，在發(fā)酵第168 h時，生物量達到最大值，其生物量干重為11.425 6 g/L。胞內茯苓多糖在24～96 h內最快，并在第96 h時，多糖含量為1.459 1 g/L，在96 h后積累緩慢，在發(fā)酵第192 h時，多糖含量達到1.527 3 g/L。發(fā)酵液的pH在0～96 h內逐漸降低，在發(fā)酵96～192 h時，逐漸平緩，但第192 h后，在衰亡期稍有浮動。

圖1 茯苓發(fā)酵過程中各理化指標的變化

2.2 胞內羧甲基茯苓多糖發(fā)酵動力學模型的建立

2.2.1 茯苓生長動力學模型

圖1可知，由于茯苓在168 h后進入衰亡期，而在0～168 h時茯苓處于生長期和穩(wěn)定期，故本研究擬對發(fā)酵0～168 h時期茯苓生長情況進行非線性擬合。采用模型Logistic模型、Sigmoid模型和SGompertz模型對茯苓生長情況進行非線性擬合，由表1可知，3個模型偏差因子BF均在0.90～1.05，即3個模型都能夠很好地預測茯苓的生長狀況，而由相關系數(shù)R2和準確因子AF更接近于1更好預測，均方誤差MSE越小越好，可得SGompertz模型相比其他2個模型更適合用于對胞內羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程茯苓的生長情況進行定量描述。擬合曲線如圖2 所示。

表1 茯苓生長擬合方程及其評價

圖2 茯苓發(fā)酵過程中的生長擬合曲線

2.2.2 胞內羧甲基茯苓多糖生成動力學模型

由表2可得，3種模型對胞內羧甲基茯苓多糖生成情況擬合，其相關系數(shù)R2均為0.98左右，而偏差因子BF均在0.90～1.05，說明3種模型均能很好預測胞內羧甲基茯苓多糖的生成狀況，由于Logistic模型的準確因子AF更接近于1，均方誤差MSE更小，所以選用Logistic模型對胞內羧甲基茯苓多糖發(fā)酵過程中的生成情況進行定量描述。擬合曲線如圖3所示。

表2 胞內羧甲基茯苓多糖的生成擬合方程及其評價

圖3 茯苓發(fā)酵過程中胞內羧甲基茯苓多糖生成擬合曲線

2.2.3 底物(還原糖)消耗動力學模型

由表3可知，3種模型的偏差因子BF均在0.90～1.05，說明3種模型均能很好地預測還原糖的消耗狀況，雖然Logistic模型的準確因子AF小于其他模型，但是其相關系數(shù)R2小于其他模型并且其均方誤差MSE偏大，而Sigmoid模型和DoseResp模型經(jīng)驗證得到的參數(shù)一樣，所以Sigmoid模型和DoseResp模型均可以用于定量描述發(fā)酵過程中還原糖的消耗情況。其擬合曲線分別如圖4、圖5。

2.3 比生長速率、比合成速率與比消耗速率研究

由圖6可知，在限制性條件下發(fā)酵的茯苓菌體生長的初期受發(fā)酵液底物高濃度抑制或菌體生長速度較慢，隨后菌體生長加快，當茯苓菌體生長的比生長速率達到最大比生長速率后會逐漸降低甚至菌體停止生長，即茯苓的菌體比生長速率呈現(xiàn)一個“鐘”形曲線，表示每小時單位質量的菌體所增加的菌體量[34]。另外微生物產(chǎn)物生成的動力學模型從產(chǎn)物與菌體細胞生長的方面可以劃分為3種：1類為生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物生成與菌體細胞生長有緊密聯(lián)系；第2類是部分生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物的生成伴隨菌體細胞生長，但其生成速率與菌體生長速率部分偶聯(lián)，還與菌體積累量有關；第3類是非生長偶聯(lián)型，即產(chǎn)物合成與菌體細胞生長無直接關系，產(chǎn)物的生成速率只與已有的菌體生物量有關[35]。根據(jù)圖6可知，胞內羧甲基茯苓多糖的生成與菌體生長呈緊密的直接聯(lián)系，即為生長偶聯(lián)型。根據(jù)圖1，茯苓在0～96 h為快速生長期，隨后進入穩(wěn)定期，168 h后進入衰亡期，發(fā)酵結束。結合圖6中葡萄糖比消耗速率曲線可知，茯苓在生長穩(wěn)定期，其葡萄糖的比消耗速率是變化的。

表3 還原糖消耗的擬合方程及其評價

圖4 Sigmoid模型還原糖消耗擬合曲線

圖5 DoseResp模型還原糖消耗擬合曲線

圖6 茯苓發(fā)酵過程中比生長速率、多糖比合成速率、葡萄糖比消耗速率隨時間的變化曲線

3 結論

目前利用茯苓發(fā)酵制備羧甲基茯苓多糖的發(fā)酵動力學研究還未見文獻報道，本文通過Logistic模型、Sigmoid模型、SGompertz模型以及DoseResp模型能夠較好地對茯苓生長、胞內羧甲基茯苓多糖生成和還原糖消耗進行非線性擬合，并采用均方誤差(MSE)、準確因子(AF)和偏差因子(BF)對擬合模型進行可靠性評價，所選模型能夠較好地描述胞內羧甲基茯苓多糖的發(fā)酵過程的動力學特征，從而為羧甲基茯苓多糖進一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

通過對比生長速率、比合成速率與比消耗速率研究，茯苓的比生長速率、胞內羧甲基茯苓多糖的比合成速率在整個發(fā)酵過程中隨時間的變化趨勢與聯(lián)系，可知胞內羧甲基茯苓多糖的生成與菌體生長是生長偶聯(lián)型的。