酵母菌株及陳釀時間對桑葚酒主要理化指標和抗氧化能力的影響

孔燕，楊蕊羽，張明慧，付云云，廖麗，姜林君，陳安均

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625000)

桑葚(Mulberry)又名桑棗、桑果、文武實等，為桑樹(MorusalbaL.)所結的聚合型多肉漿果[1]。果肉柔嫩多汁，營養豐富，風味獨特，而且色澤誘人[2]。桑葚中含有豐富的酚酸類物質，主要有花色苷、白黎蘆醇、黃酮等[3]。酚酸類物質可以清除人體內自由基，起到舒展血管的作用；還具有抗癌、抗過敏的作用；能夠抑制脂肪氧化酶等酶的活性[1]。

桑葚酒的釀造主要是在酵母的作用下，通過酒精發酵將桑葚變成桑葚酒。在桑葚酒生產中，酵母菌株的選擇尤為重要，與發酵工藝共同影響著桑葚酒的品質[4]。

剛發酵后的桑葚酒不適宜直接飲用，需經過儲藏一定時間，使不良風味消除或減少，同時生成新的芳香物質，使酒體綿軟適口，醇厚香濃，口味協調。陳釀過程中發生復雜且緩慢的物理化學和生物化學變化[5]。包括單寧與單寧、單寧與花色苷、花色苷與花色苷之間的聚合與解離，桑葚酒的果香逐漸降低，醇香逐漸上升等。同時，在儲藏期間，褐變與氧化反應對桑葚酒產生重要影響，二者會影響桑葚酒的感官特征及抗氧化特性[6]。

本實驗采用RC212、D254、71B、F15和KD五株商業釀酒酵母釀制桑葚酒，再將桑葚酒陳釀，研究不同酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒主要理化指標和抗氧化能力的影響。目前人們對果酒的需求除了口感和品質之外，保健功能也是人們日益關注的問題。因此，選擇能發酵出具有較高抗氧化能力的桑葚酒的菌株，并且明確桑葚酒在陳釀過程中抗氧化能力的變化規律具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮桑葚，購自雅安農貿市場，品種為黑珍珠；酵母D254、RC212、71B，法國拉曼公司；酵母F15，法國拉氧德公司；酵母KD，法國馬丁威蘭特公司。

焦亞硫酸鈉(食品級)，一諾生物科技有限公司；NaOH、葡萄糖、乙醇、HCl、醋酸鈉、KCl、Na2CO3、鐵氰化鉀、NaH2PO4、Na2HPO4、焦性沒食子酸、福林酚試劑、三氯乙酸、ABTS(2，2-聯氮基-雙-(3-乙基苯丙二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)、過硫酸鉀、VC、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(均為分析純)，成都市科隆化學品有限公司。

1.1.2 儀器與設備

SHP型生化恒溫培養箱，北京中興偉業儀器有限公司；Varioskan Flash熒光酶標儀，美國Thermo公司；Ulupure超純水儀，成都優普；DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器廠；DHG-9101型電熱鼓風干燥箱，上海三發科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚酒的釀制工藝

挑選無病蟲害的新鮮桑葚，清洗干凈，加入80 mg/kg SO2，室溫密封處理3 h，添加蔗糖，調整糖分為20 Brix，分別接種0.03%酵母RC212、D254、71B、F15和KD，20 ℃發酵，酒精發酵結束后，皮渣分離，調整SO2濃度為80 mg/kg，室溫下避光陳釀，發酵結束和陳釀的第2、3、6月進行倒罐、取樣、-20 ℃保存。

1.2.2 主要理化指標的測定

測定5株菌株發酵桑葚酒的酒精度、總糖、總酸，測定方法按照國標GB/T15038—2006中的方法測定。

1.2.3 總酚含量的測定

參照朱明明等[7]的方法，采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)法測定桑葚酒中總酚的含量。以焦性沒食子酸為標準品繪制標準曲線。用蒸餾水將桑葚酒樣品稀釋50倍，取1 mL稀釋溶液至10 mL刻度試管中，加入1 mL福林酚顯色劑，再加入3 mL質量分數為7.5%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，室溫避光靜置1 h，于波長760 nm處測定吸光值，以不加福林酚的酒樣作為空白對照。根據焦性沒食子酸標準曲線回歸方程，計算樣品中總酚含量，桑葚酒中總酚含量以每升桑葚酒毫克焦性沒食子酸當量表示(g GAE/L)。

1.2.4 總花色苷含量的測定

參照焦揚等[8]的方法，采用pH示差法測定桑葚酒中總花色苷的含量。將桑葚酒樣品稀釋5倍。取1 mL稀釋溶液，分別用pH=1的KCl-HCl緩沖溶液和pH=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL，混勻，避光條件下靜置30 min，分別在520和700 nm處測定吸光值，以蒸餾水為空白。總花色苷含量的計算公式(1)、(2)為：

ΔA=(A520-A700)pH=1.0-(A520-A700)pH=4.5

(1)

(2)

式中：DF，稀釋倍數；MW，矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相對分子質量，449.2；ε，Cy-3-Glu的消光系數，26 900 L/(mol·cm)；n，液層的厚度，cm。

1.2.5 還原鐵能力的測定

參照屈慧鴿等[9]的方法，采用普魯士藍法測定桑葚酒中還原鐵的能力。以焦性沒食子酸為標準品繪制標準曲線。用蒸餾水將桑葚酒樣品稀釋25倍，取1 mL稀釋液，依次加入2 mL磷酸緩沖液(pH=7.8)，2 mL鐵氰化鉀溶液(0.25%)，混勻，60 ℃水浴25 min，再加入1 mL三氯乙酸溶液(9%)，冷卻至室溫，分別移取1 mL反應液至2支10 mL具塞比色管中，其中一支用蒸餾水定容至10 mL做空白，另一支加入1.6 mL FeCl3溶液(0.05%)，再用蒸餾水定容至10 mL，混勻，靜置20 min后，在波長691 nm處測定吸光度值。根據焦性沒食子酸標準曲線回歸方程，計算樣品還原鐵的能力。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測定

參照牛廣財等[10]的方法，以焦性沒食子酸為標準物質繪制標準曲線。將酒樣稀釋300倍后，取2 mL樣品稀釋液，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，搖勻，避光靜置40 min，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光度，再在相同波長下測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度。根據焦性沒食子酸標準曲線回歸方程，計算樣品清除DPPH自由基的能力。

1.2.7 ABTS自由基清除能力的測定

參照徐艷巖[11]的方法，將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液各取100 mL混合，置于暗處反應12 h，產生ABTS+，配置成ABTS+儲備液，用無水乙醇將ABTS+溶液稀釋，使其在734 nm波長條件下的吸光度為0.70±0.02。以VC為標準物質繪制標準曲線。用蒸餾水將酒液稀釋100倍，取2支試管，1號管加入0.4 mL無水乙醇，再加入3.6 mL ABTS+工作液；2號管加入0.4 mL酒樣待測液，再加入3.6 mL ABTS+工作液，混勻后2管均暗處反應10 min。以無水乙醇作為空白對照，在734 nm波長處測量吸光度。根據VC標準曲線回歸方程，計算樣品清除ABTS自由基的能力。

1.2.8 實驗數理統計分析

實驗至少重復3次，各指標均為3組平行，結果表示為平均值±SD，采用IBM SPSS Statistics 24軟件對數據進行統計分析，采用Origin 8.5軟件作圖，相關性分析采用相關系數法，顯著性界值為P<0.05，極顯著界值為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 桑葚酒在陳釀過程中主要理化指標分析

2.1.1 陳釀過程中酒精度的變化

不同菌株發酵的桑葚酒在陳釀過程中酒精度的變化情況如表1所示。KD發酵酒酒精度最高，為8.87%vol，D254發酵酒酒精最低，為7.49%vol。這可能是由于不同酵母自身代謝存在差異，利用發酵醪中營養成分的能力也有所不同引起的[12]。RC212和F15發酵酒在陳釀過程中酒精度的變化差異不顯著，另外3株菌株發酵酒酒精度差異顯著(P<0.05)。陳釀過程中酒精度減少的原因可能是：(1)乙醇與酸(主要有乙酸與乳酸)緩慢反應生成酯，增加酒的陳香；同時乙醇也可氧化成醛，醛再氧化成酸，為酯化創造了條件；(2)在陳釀貯存的過程中，乙醇會揮發逸走[13]。酒精度增加的原因可能是在陳釀的過程中總糖分解轉化成乙醇[14]。

表1 不同菌株發酵的桑葚酒在陳釀過程中酒精度的變化

注：小寫字母不同表示同一行之間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 陳釀過程中總糖的變化

由表2可知，發酵結束后，F15發酵酒總糖含量最高，為4.10 g/L，71B發酵酒總糖含量最低，為3.40 g/L，說明在酒精發酵的過程中，不同酵母轉化糖的情況存在差異。在陳釀過程中，71B菌株發酵酒總糖含量的變化不顯著，另外4株菌株發酵酒變化顯著(P<0.05)。糖含量降低的原因在于桑葚酒貯存過程中糖轉化為乙醇，或與氨基酸發生美拉德反應，生成葡萄糖酸，消耗部分糖，但受貯存條件如氧、溫度的限制，該反應非常緩慢[13]。糖含量增加的原因可能是酒液在貯存過程中揮發逸出，濃度增加，也使糖分相應提高[14]。

2.1.3 陳釀過程中總酸的變化

不同菌株發酵結束后總酸的含量如表3所示，F15發酵酒總酸含量最高，為9.28 g/L，71B發酵酒總酸含量最低，為8.71 g/L，這和不同菌株代謝差異有關。在陳釀過程中，5株菌株發酵酒中總酸的含量均呈顯著性變化(P<0.05)。陳釀過程中總酸含量增加的原因，一方面是由于酒的揮發造成桑葚酒體積的減少；另一方面是在陳釀過程中醛類物質會逐漸氧化而生成酸[13]。而總酸降低的原因可能是酒石酸沉淀引起的[15]。NY/T 1508-2017《綠色食品 果酒》規定，果酒中總酸的含量為4～9 g/L(以酒石酸計)[16]，5株酵母菌株發酵的桑葚酒在陳釀過程中總酸含量部分超過了9 g/L，因此，在釀造過程中應進行降酸處理[17]。

表2 不同菌株發酵的桑葚酒在陳釀過程中總糖的變化

表3 不同菌株發酵的桑葚酒在陳釀過程中總酸的變化

2.2 桑葚酒在陳釀過程中抗氧化活性分析

2.2.1 陳釀過程中總酚含量的變化

總酚是對桑葚酒中的酚含量的綜合評價。由圖1可知，發酵結束時，RC212和71B發酵酒中總酚含量較高，分別為4.07 g GAE/L和3.69 g GAE/L。這可能是因為不同菌株適應桑葚發酵醪體系的能力不同，RC212和71B在發酵過程中，對打破整個體系平衡的能力和對具有抗氧化性物質的破壞能力較低，因此使得桑葚中原有的一些活性物質能夠較好地保存下來[18]。劉寅[19]發現在發酵過程中，不同酵母對多酚物質的吸附作用不同；李蒙蒙等[20-22]認為，不同菌種的酶系組成會導致其酶解催化作用各異，溶出的酚類物質含量也有所差異。隨著陳釀時間的延長，總酚濃度呈逐漸下降的趨勢，這與歐燕等[22]的研究結果一致。當陳釀至6個月時，KD發酵酒中總酚濃度最高，為2.08 g GAE/L。這表明，在陳釀過程中，5株菌株對桑葚酒中總酚濃度下降速率影響不一致。陳釀過程中總酚濃度下降的原因可能是，單寧類等物質聚合、酚類物質氧化、微生物產生的酶促反應使多酚類物質發生降解，多酚類物質的水溶性下降，產生沉淀現象，也就是常說的酒腳，從而使桑葚酒中總酚濃度呈下降趨勢[5,21-22]。

圖1 酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒中總酚含量的影響

2.2.2 陳釀過程中總花色苷含量的變化

花色苷是桑葚酒主要的呈色物質，對桑葚酒的感官品質和功能活性具有重要的影響。由圖2可知，發酵結束時，71B菌株發酵酒中花色苷含量最高，為825.85 mg/L，菌株D254發酵酒中花色苷含量最低，為489.65 mg/L。這可能是不同菌株對花色苷的浸提作用不一致導致的，β-葡萄糖苷酶活力低的菌株發酵酒中花色苷含量較高，相反，β-葡萄糖苷酶活力高的菌株發酵酒中花色苷含量較低[23]。隨著陳釀時間延長，花色苷的含量逐漸下降，這與房玉林等[6]、王宏等[24]的研究結果相似。SILVIA等[25]研究發現，葡萄酒在陳釀的過程中，游離花青素含量下降，花青素衍生物的含量增加。經過6個月的陳釀，菌株KD和D254發酵酒中花色苷含量相對較高，這表明，在陳釀過程中，不同菌株發酵酒中的花色苷下降的速率不一樣。PERI等[26]發現，Kalecik karasi、Shiraz、Bogazkere、Okuzgozu葡萄酒在陳釀1～7年后總花青素含量降低了44%～88%(P<0.05)。總花色苷含量在陳釀過程中逐漸下降，可能是因為花色苷類間相互聚合或者同酒中的其他酚類物質相互聚合，進而形成了穩定的縮合單寧(即原花青素類)，且酵母也會對果酒中的花色苷具有吸收作用，導致花色苷含量降低，與此同時，隨著陳釀時間的增加，桑葚酒中的酸度值有所變化，花色苷的溶解受到影響并破壞各種花色苷間的平衡，多種因素的共同作用，導致花色苷含量下降[27]。

圖2 酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒中總花色苷含量的影響

2.2.3 陳釀過程中還原鐵(ferric reducing ability of plasma，FRAP)能力的變化

天然化合物的抗氧化性與其還原能力具有一定的相關性，因此測定物質還原能力可反映它們的抗氧化性[28]。由圖3可知，未陳釀的桑葚酒比陳釀后的桑葚酒還原鐵能力強，其中菌株F15還原鐵的能力最高，為3.51 g GAE/L，可能和不同菌株發酵酒中總酚和總花色苷的含量和種類不同有關。隨著陳釀時間的延長，還原鐵的能力逐漸下降，這與TSAI等[29]的研究結果一致，他們發現，桑葚酒陳釀12個月之后，FRAP能力從5 720 μmol/L降至4 630 μmol/L。在陳釀的第6個月，菌株KD發酵酒還原鐵的能力最高，為2.48 g GAE/L，表明在陳釀過程中，不同菌株發酵酒還原鐵的能力呈現不同程度的下降趨勢。

圖3 酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒還原鐵能力的影響

2.2.4 陳釀過程中清除DPPH自由基能力的變化

DPPH自由基通過抗氧化化合物提供氫原子從而被還原[6]。對自由基的清除能力越強，表明酒體的抗氧化能力越強。由圖4可知，F15菌株發酵結束后的桑葚酒清除DPPH自由基的能力最強，為2.16 g GAE/L。在陳釀至第6個月時，菌株RC212、D254、71B和F15發酵酒清除DPPH自由基的能力均低于發酵結束時的桑葚酒，而KD菌株發酵的桑葚酒清除DPPH自由基的能力有所上升。有報道表明，桑葚細胞壁在微生物酶的作用下解聚并釋放出蛋白質、糖苷等植物胞內成分，一定程度上會影響其DPPH自由基清除能力[30]。

圖4 酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒清除DPPH自由基能力的影響

2.2.5 陳釀過程中清除ABTS自由基能力的變化

由圖5可知，F15菌株發酵結束后的桑葚酒清除ABTS自由基的能力最強，為5.52 g VC/L，這與還原鐵能力和DPPH自由基清除能力的測定結果一致。LIU等[21]研究了SF、SY、RW、D254和RC212五株菌株對發酵桑葚酒抗氧化活性的影響，發現D254和RC212清除ABTS自由基的能力分別為360.39和434.83 mg TE/100 mL，這與本研究相似。LI等[31]研究發現，CR476、JH-2、WLP77、RC212、RA17和BM4X4六株菌株發酵的獼猴桃酒中，RC212發酵的獼猴桃酒清除ABTS自由基的能力最強，并且總酚含量最高、清除DPPH自由基的能力也最強。隨著陳釀時間的延長，各菌株發酵的桑葚酒清除ABTS自由基的能力逐漸下降，當陳釀至第6個月時，菌株KD發酵的桑葚酒清除ABTS自由基的能力最強，為4.25 g VC/L。

圖5 酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒清除ABTS自由基能力的影響

2.2.6 相關性分析

由表4可知，總酚、總花色苷、FRAP、DPPH和ABTS自由基清除能力5個指標兩兩均呈極顯著的正相關(P<0.01)。焦揚等[8]發現果酒中多酚和總花色苷含量與ABTS自由基的清除率呈正相關，DPPH自由基的清除率與果酒中總花色苷的含量呈正相關，而總酚、總花色苷含量與FRAP均無顯著性關系(P<0.05)。郭玉呈等[32]發現發酵柿子酒中的總酚含量與其清除ABTS自由基活性極顯著正相關(r=1，P<0.01)。

表4 活性物質含量與抗氧化能力的相關性

注：**表示在0.01級別(雙尾)相關性顯著

3 結論

酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒的酒精度、總糖和總酸均有影響。在陳釀過程中，RC212和F15發酵酒酒精度變化不顯著，D254、71B和KD變化顯著(P<0.05)；71B菌株發酵酒中總糖含量的變化不顯著，RC212、D254、F15和KD變化顯著(P<0.05)；5株菌株發酵酒中總酸的含量均呈顯著性變化(P<0.05)。

酵母菌株和陳釀時間對桑葚酒的抗氧化能力也有影響，酵母菌株對發酵醪的適應情況不同，對酒中抗氧化物質的破壞程度也不一樣，導致酒體中的抗氧化能力存在差異。隨陳釀時間的延長，桑葚酒中的總花色苷含量、FRAP、DPPH和ABTS自由基清除能力都有一定程度的降低，與總酚含量的變化趨勢相似，說明桑葚酒陳釀時間越長，抗氧化能力越弱。由相關性分析可知，5個指標的相關性極顯著(P<0.01)。5株酵母菌株中，71B和F15發酵酒抗氧化能力相對較高。

本實驗比較了5株釀酒酵母和陳釀時間對桑葚酒的主要理化指標和抗氧化能力的影響，篩選出了發酵酒體抗氧化能力較優的菌株，明確了陳釀時間對桑葚酒抗氧化能力的影響規律，為桑葚酒的工業生產提供了理論依據。