微波輔助糖基化對大豆分離蛋白乳化性的影響

宋旸，劉影

(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是許多食品配方中的重要成分，其氨基酸組成和比例平衡且合理，可以與動物蛋白相媲美，能夠替代和拓展動物蛋白在食品體系中的功能作用[1]。為了滿足工業上對專用功能型大豆分離蛋白的需求，常采用改性的手段來顯著改善大豆分離蛋白的某一功能特性。糖基化改性是通過美拉德反應與糖進行接枝改性,這種改性方式不需要催化劑，安全可靠。KATO等[2]在1988年研究表明了乳清蛋白的功能性質可以通過與葡聚糖的糖基化反應得到改善，從此利用蛋白質的糖基化改性提高功能性特性逐漸成為人們研究的熱點[3-12]。

葫蘆巴是一種生長在北非，地中海，西亞，北印度并且現在在加拿大也培育的豆科植物。葫蘆巴膠(fenugreek gum，FG)是一種半乳甘露聚糖，具有很好的表面活性，可以作為一種有效的水包油乳化液的穩定劑[13]。在11種商業用膠和5種實驗室制備膠中葫蘆巴膠在水包油乳狀液模型系統中表現出最好的穩定性[14]。KASRAN等[15]研究了大豆乳清分離蛋白與葫蘆巴膠在干熱的條件下進行美拉德共價交聯反應，使乳化特性得到提高。但采用干法進行糖基化改性普遍存在耗時長、能耗大、不適合工業生產等缺點。本文利用微波輔助大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的糖基化反應，通過微波作用使大豆分離蛋白結構變得更加松散，使內部包埋的基團暴露，加快糖基化反應的進程，大大縮短了糖基化反應的時間。該文研究了不同的微波時間、大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的質量比、糖基化反應時間、反應溫度對大豆分離蛋白乳化性的影響，通過響應面法優化出最佳改性條件，考察了結合物乳化性的變化，使大豆分離蛋白能夠更好地應用在工業生產之中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，河南萬邦實業有限公司；葫蘆巴膠，中凱食品配制有限公司；十二烷基磺酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；大豆油，九三集團非轉基因大豆油；Na2HPO4和Na2HPO4，長春化學試劑廠；KBr，天津市博迪化工有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

海爾微波爐(MK-2485MG)，青島海爾微波制品有限公司；高速分散機(T18)，德國IKA公司；紫外可見分光光度計(UV-5100)，上海元析儀器有限公司；冷凍干燥機(FD5)，美國SIM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微波輔助糖基化SPI的乳化液制備

將SPI與FG以一定的質量比均勻混合后，用水溶解調至6%，利用功率為850 W的微波爐進行輻射加熱，為了防止升溫過快, 采用間歇式加熱, 即微波輻射3 min，冰浴3 min，使溫度降下來并停止反應，再進行微波輻射[16]；微波處理一定時間后于-20 ℃保存再冷凍干燥。將干燥后的粉狀物放置在底部含有飽和NaCl溶液的干燥器內進行反應,保持溫度60 ℃,相對濕度75%[15]。

1.3.2 大豆分離蛋白乳化性的測定[17]

用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制1 mg/mL大豆分離蛋白溶液，取30 mL樣品，加入10 mL大豆油以轉速為10 000 r/min在室溫下均質1 min形成均勻的乳化液然后靜置。分別在靜置后的第0 min和第10 min從乳化液底部吸取100 μL，用5 mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)稀釋，在500 nm條件下測定吸光值。乳化活性(EA)用0 min的樣品吸光值A0表示，乳化穩定性(ES)用乳化穩定指數(ESI)表示為A0×Δt/ΔA,其中Δt為時間差10 min，ΔA為Δt內的吸光值之差。

1.3.3 糖基化程度的測定

參考LERTITTIKULA等[18]的方法測定糖基化程度。將125 μL改性SPI溶液加入pH 8.2的2 mL 0.21 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，與1 mL 0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液混勻并充分振蕩，置于50 ℃水浴中避光反應1 h，再將2 mL 0.1 mol/L Na2SO3溶液置于反應液中，在室溫下冷卻30 min，在420 nm處測定吸光度At。然后在上述溶液中加入125 μL未經水浴加熱的SPI溶液作為空白對照，于420 nm處測定其吸光度A0，根據公式(1)計算糖基化程度：

(1)

式中：A0表示未經改性SPI吸光度；At表示改性SPI吸光度。

1.3.4 改性產物的表征

1.3.4.1 紅外光譜分析[19]

改性前后的樣品分別準確稱取10 mg，將一定量的KBr加入其中，研磨成均勻粉末后，壓制成薄片，并用傅里葉變換紅外光譜儀測試。

1.3.4.2 紫外光譜分析[20]

用50 mmol/L、pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液配制樣品濃度為10 g/L，測量在不同波長下的吸光度值。

1.3.5 單因素實驗

1.3.5.1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質量比1∶3，反應時間為30 min時，反應溫度為60 ℃，考察微波時間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.2 SPI與FG質量比對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質量比1∶3，微波時間3 min，反應時間為30 min時，反應溫度為60 ℃，考察SPI與FG質量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.3 反應時間對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質量比為1∶3，微波時間3 min，反應溫度為60 ℃，考察干燥器反應時間為0、5、10、30、50、70、90、110 min時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.4 反應溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質量比1∶3，微波時間3 min，反應時間為30 min時，使其反應溫度分別是40、50、60、70、80 ℃時對SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.6 響應面分析法優化工藝

依據上述單因素實驗的討論，根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理[21-22], 采用響應面法[23]在3因素3水平上對微波輔助糖基化改性SPI條件進行優化。對試驗數據結果采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平表

2 結果與分析

2.1 單因素實驗分析

2.1.1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖1、圖2可以看出，在SPI與FG質量比1∶3、反應時間30 min、糖基化反應溫度60 ℃時, 隨著微波時間的延長，乳化活性、乳化穩定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在微波時間在3 min時均達到最高值。這是由于適當的微波處理SPI能夠減弱蛋白分子間和分子內的非共價作用，SPI的結構變得松散，暴露更多的糖基化反應位點，從而促進糖基化反應的發生，同時引入更多含有親水羰基的糖鏈[24]。由于FG以共價鍵連接入SPI肽鏈中，增加了空間阻力，使得界面蛋白很難發生聚合，從而提高其乳化活性和乳化穩定性。但過度的微波預處理，就會使得蛋白分子重新聚集，SPI糖基化反應減弱，乳化活性和乳化穩定性也隨之降低[25]。

圖1 微波時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖2 微波時間對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.2 SPI與FG質量比對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖3、圖4可以看出，在微波3 min、反應時間30 min、糖基化反應溫度60 ℃時，隨著質量比的增加，乳化活性、乳化穩定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在質量比為1∶3時均達到最高值。當FG的質量增加時，單位體積內與SPI分子接觸的糖分子數量就會變多，糖基化反應的速率就會變大，乳化活性和乳化穩定性呈上升趨勢；但隨著添加的葫蘆巴膠的量繼續增加，由于不適當的SPI和FG比例導致加劇副反應(焦糖化)的發生以及FG分子的空間位阻對糖基化反應有阻礙，所以隨著FG的繼續添加，乳化活性和乳化穩定性呈下降的趨勢[26]。

圖3 SPI與FG質量比對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖4 SPI與FG質量比對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.3 反應時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖5、圖6可以看出，在SPI與FG質量比1∶3、微波3 min、糖基化反應溫度60 ℃時，隨著反應時間的增大，乳化活性、乳化穩定性都是先上升后下降，反應時間在30 min時均達到最高值；糖基化程度呈逐漸增大的趨勢，在30 min后趨于平緩。微波輔助糖基化的反應時間逐漸增大到30 min時，SPI和FG糖基化反應程度逐漸加深，糖基化SPI降低了油水界面的張力，乳化能力有所提高[27]。隨著反應時間的繼續延長，過多的葫蘆巴膠接枝到SPI，體現出顯著的親水性，所以糖基化SPI的乳化性開始呈下降的趨勢[28]。

圖5 反應時間對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖6 反應時間對微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.4 反應溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖7、圖8可以看出，在SPI與FG質量比1∶3、微波3 min、反應時間30 min時，隨著糖基化反應溫度的增加，乳化活性、乳化穩定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢，在60 ℃均達到最高值。說明溫度為60 ℃時，SPI糖基化反應的效果較好，顯著地降低了油水界面的張力，提高了SPI的乳化性。但隨著溫度的繼續升高，大豆分離蛋白由于高溫容易發生熱變形，阻礙了糖基化反應的進行，所以糖基化的程度降低，乳化性也呈下降的趨勢[29]。

圖7 糖基化反應溫度對微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖8 糖基化反應溫度對微波輔助糖基化SPI糖基化程度的影響

2.2 微波輔助糖基化SPI乳化穩定性的響應面分析

在單因素實驗的基礎上，以反應時間(A)、微波時間(B)、反應溫度(C)為自變量，以乳化穩定性(ES)為響應值，進行響應面分析實驗，實驗結果見表2。

表2 響應面所設計的方案和實驗結果

利用Design Expert 8.0.6軟件設計實驗方案，對實驗結果進行二次回歸方程的分析，可以得出，SPI乳化穩定性Y的二次回歸方程，并對它用方差的方法分析(見表3)可知。乳化穩定性Y的標準回歸方程為：

Y=372.01-7.69A+8.15B+15.60C+8.30AB-20.36AC-13.40BC-164.83A2-135.49B2-109.26C2

模型的決定系數與調整決定系數分別為0.965 0、0.9200，說明此模型與試驗之間擬合程度較高，證明用此模型優化反應時間、微波時間和反應溫度對微波輔助糖基化改性SPI影響具有可行性。由反應時間、微波時間、反應溫度對響應值的影響可以得出，回歸方程Y中的A2、B2、C2對微波輔助糖基化SPI的乳化穩定性都有明顯的影響，而其他因素影響不是很明顯，表明各影響因素對于微波輔助糖基化SPI的影響不是簡單的線性關系。用中心標準化處理回歸方程，Y回歸方程一次項回歸系數的絕對值大小依次為C、B、A，因此，3個影響因素對乳化穩定性影響順序為：反應溫度(C)>微波時間(B)>反應時間(A)。

表3 乳化穩定性試驗結果的方差分析表

對模型中的反應時間(A)、微波時間(B)、反應溫度(C)其中的一個因素讓它在0水平不動時，由此可知，另外2個影響因素相互交叉作用對乳化穩定性Y的子模型，并根據子模型，分別繪制出a、b、c三個三維響應曲面圖，見圖9。

圖9說明了各因素對微波輔助糖基化SPI乳化穩定性的影響。由圖9-a、9-b、9-c可以看出，3個因素與Y呈拋物線關系，隨著反應時間、微波時間和反應溫度的增加，乳化穩定性先呈不同程度的上升趨勢，先達到最高點后，繼而隨著各影響因素值的增加，乳化穩定性呈下降趨勢，這與單因素的實驗結果不約而同。并且由圖9-a和圖9-b可以看出，與反應溫度和微波時間相比，反應時間對SPI乳化活性的影響相對較小。

通過所得到的模型，可預測采用微波輔助糖基化法提高SPI乳化穩定性的最好的工藝條件為：反應時間41 min、微波時間3 min、反應溫度58 ℃。在此條件下，微波輔助糖基化法SPI乳化穩定性(OD500)在理論上可達371.156 min。

2.3 驗證實驗

根據上述結果進行近似驗證試驗，檢測真實值是否與試驗結果相一致。在最佳工藝條件下進行3次平行試驗，測得微波輔助糖基化SPI的乳化穩定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比，相對誤差在±1%以內，而且重復性好，說明優化結果是準確可靠的。

a-反應時間和微波時間對乳化穩定性影響的響應面圖;b-反應時間和反應溫度對乳化穩定性影響的響應面圖;c-微波時間和反應溫度對乳化穩定性影響的響應面圖

2.4 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對比

由圖10可以看出，在最佳的微波輔助糖基化改性條件下，將未改性的SPI、微波改性SPI和微波輔助糖基化SPI的乳化性進行對比，未改性SPI的乳化活性和乳化穩定性數值最小，微波輔助糖基化SPI的乳化活性和乳化穩定性數值最大，微波改性SPI的乳化活性和乳化穩定性數值處于二者之間。由此，可知微波輔助糖基化可以顯著提高SPI的乳化性。

圖10 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對比

2.5 紅外光譜分析

圖11 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紅外光譜圖

2.6 紫外光譜分析

紫外光譜是研究蛋白質構象的一種方法，主要體現在芳香族氨基酸。由圖12可知，蛋白吸收峰有所變化。微波改性的SPI吸收峰高于未改性的SPI，在270 nm附近處的吸光值也高于未改性SPI，這可能是因為微波過程中使蛋白質疏水性生色基團露出從而使吸光值變大。微波輔助糖基化改性后的SPI在280 nm附近的吸收峰弱于未改性的SPI，并向短波方向移動，說明了SPI與FG發生了共價交聯[31]，使蛋白分子空間結構發生了變化，導致酪氨酸和色氨酸對紫外線的吸收降低。

圖12 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紫外光譜圖

3 結論

在單因素實驗基礎上，并通過對顯著影響因素反應時間、微波時間和反應溫度做響應面分析，確定微波輔助糖基化的最佳工藝條件為反應時間41 min、微波時間3 min、SPI與FG質量比1∶3和反應溫度58 ℃。其制備的微波輔助糖基化SPI的乳化穩定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比差異不顯著。

在最佳工藝下制備的微波輔助糖基化SPI乳化穩定性有較大的提高,與微波改性的SPI相比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了51.33%，乳化穩定性提高了294.14%；與未改性的SPI對比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了88.67%，乳化穩定性提高了788.84%。

紅外光譜和紫外光譜分析得知，改性前后SPI的各吸收峰強度均有不同程度的變化，因此表明SPI與FG之間發生了共價交聯，改變了蛋白分子空間結構。