Bacillus amyloliquefaciens KHQH-1的鑒定及其抗菌活性初步研究

付志英，陳曉波，潘潔茹，鄧優錦，賴騰強，劉彩珍

1(福建農業職業技術學院，福建 福州，350119)2(福州市疾病預防控制中心，福建 福州，350004)3(福建農林大學菌物研究中心，福建 福州，350002)

天然防腐劑易被人體消化水解且無毒副作用，是一種新型的生物防腐劑，其主要功能成分為抗菌肽，抗菌肽又叫肽抗生素、抗微生物肽，是指具有抵御外界微生物侵害、清除體內突變細胞的一類小分子肽[1]，該物質可有效抑制微生物的生長。其主要來源于動物、植物和微生物等，因微生物來源的天然抗菌物質生產成本低、周期短、效率高、效果好等優點，甚至可直接通過微生物菌體的拮抗、競爭作用抑制或殺滅病菌，而達到對果蔬進行防腐、抑菌及保鮮的作用[2],因此，生物拮抗菌成為近年食品微生物研究的熱點之一，探究對微生物天然防腐保鮮劑開發利用的有效途徑，以期廣泛應用于食品防腐保鮮領域。

近年來，不同來源的解淀粉芽孢桿菌不斷被鑒定，并且分析其抑菌效果，如蔡國林等[3]研究了解淀粉芽孢桿菌胞外多糖抑制大腸桿菌的血凝性；尹珺伊等[4]從玉米種植地土壤中分離并堅定了解淀粉芽胞桿菌SSY2，并研究對霉菌的拮抗效果；陳建軍等[5]從海底淤泥樣品中分離鑒定了BacillusamyloliquefaciensMBRC1，并研究其抗菌活性；SHAHZADI等[6]分離鑒定了1株煤油降解細菌(解淀粉芽孢桿菌6a)。解淀粉芽孢桿菌在果蔬防腐保鮮方面的應用研究也有報道，洪鵬等[7]對解淀粉芽孢桿菌防治果蔬采后病害研究情況進行了綜述，同時有學者對其防治效果進行探索，如CALVO等[8]研究了buz-14在采后水果腐爛中的作用；耿陽陽等[9]將解淀粉芽孢桿菌發酵液應用于新鮮核桃的保鮮。近年來，解淀粉芽孢桿菌在生物防治方面的研究也時有報道，如CUI等[10]研究發現，b9601-y2可使玉米葉枯病病情指數下降61.38%；AGUSTIN等[11]對83對不同生理階段炭疽病菌生長和生存能力的影響進行研究；ZHANG等[12]發現并鑒定了解淀粉芽孢桿菌6256能夠產生抗真菌小肽。鄺格靈等[13]和趙龍等[14]分別研究了解淀粉芽孢桿菌對食醋風味和醬油釀造的影響。從近年對解淀粉芽孢桿菌的研究可知，該菌在食品防腐保鮮、生防、環境保護、發酵等方面具有很大的開發利用價值和潛力。

前期課題組在對柑橘的防腐保鮮研究中，從柑橘上分離篩選得到1株細菌，本研究對該柑橘源細菌進行形態、生化和分子鑒定，并對其抑菌譜和抑菌活性進行初步研究，以期為進一步探索柑橘采后生防保鮮技術的應用和研究提供參考，為生物防腐劑和微生物制劑的開發與應用提供理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌 (ATCC6633-1)，購自北京陸橋技術股份有限公司； KHQH-1，由本課題組從柑橘上分離；紅曲霉(Monascusspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、青霉(Penicilliumspp.)、綠色木霉(Trichodermaviride)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等菌種,由本實驗室提供。

1.2 試劑

營養瓊脂(NA)培養基,北京陸橋技術股份有限公司；大豆酪蛋白瓊脂(TSA)平板,南通凱恒生物科技有限公司；革蘭氏染色液、盧戈氏碘液,廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂(生物試劑),杭州百思生物技術有限公司；DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 培養基

形態鑒定培養基,營養瓊脂(nutrient agar，NA)培養基。生化鑒定培養基,胰酪大豆胨瓊脂(tryptose soya agar，TSA)?？咕囼炁囵B基,馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基；馬鈴薯葡萄糖液體培養基,根據參考文獻[17]的配方，不加瓊脂。

1.4 儀器與設備

DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；HZ-HG-502N電子天平，福州衡之展電子有限公司；LDZX-40AI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司； HNY-200D臺式智能恒溫培養搖床，天津歐諾儀器股份有限公司；VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定系統(VITEK2 Compact Systems Version7.01)、VITEK?2 BCL 鑒定卡(芽孢桿菌鑒定卡)、麥氏比濁儀(DensiCHEKTM Plus)，梅里埃診斷產品(上海)有限公司；PCR 儀(Applied Biosystems)，賽默飛世爾科技中國有限公司；AB2-3S3生物安全柜，藝斯高(上海)貿易有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株形態鑒定

分離菌的純培養物接種在NA固體培養基上，37 ℃培養8～72 h定時觀察菌落顏色、形態，并進行革蘭氏染色和個體形態觀察。

1.5.2 菌株的生化鑒定

生化鑒定采用VITEK2Compact全自動微生物分析系統，該系統是目前國內應用較多的全自動細菌分析系統，具有自動化程度高、鑒定速度快的特點，目前已有部分鑒定結果準確性的報道，如孫燕萍等[15]證明革蘭氏陽性菌的準確率為97.4%(75/77)，2016年，林杰[16]使用該系統對牛乳中葡萄球菌的鑒定效果進行評價。

1.5.2.1 菌株的生化鑒定操作流程

將細菌純培養物轉移至TSA培養基上傳代培養18～24 h，實施孵育；以無菌方法，將 3.0 mL 無菌鹽水(質量分數0.45%～0.50% NaCl 溶液，pH 4.5 至7.0)加入比濁儀測試管(Ref 21255) (12×75) mm中；用無菌棉簽挑取足量細菌的菌落加入準備的比濁儀鹽水測試管，用經過校準的 VITEK? 2 DensiCHETMPlus 比濁儀按相當于 McFarland No.1.80～2.20 OD的濁度準備均質菌懸液。將菌懸液試管和 BCL 卡放入卡架中，導液管插入到菌懸液中。然后按照規定時長進行反應，結束后通過電腦端獲得打印結果(參閱 VITEK? 2 儀器使用手冊)。以上操作過程按照VITEK?2compact全自動微生物分析系統標準化操作流程(SOP)(版本7.01,梅里埃診斷產品上海有限公司)及VITEK? 2 Systems產品信息對BCL鑒定卡使用方法的指導，對分離菌株KHQH-1進行生化鑒定。

1.5.2.2 菌株生化鑒定的結果概率百分比

在鑒定過程中，軟件會將可由VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定系統鑒定的每種細菌或某細菌群的試驗反應與預期反應相比較。概率百分比是一個由軟件計算的定量數值，表示每種細菌觀察到的反應與典型反應之間的相關程度。如果某細菌或細菌群的試驗反應模式和獨特反應模式完美匹配，概率將達99%。如果不是完美的匹配，反應模式仍可能與預期反應模式足夠接近，可以此(表1)明確鑒定細菌。單選時，概率為85%～99%。數值越接近99%，表示越接近特定細菌的典型模式， BCL卡的模式菌菌種為ATCC 51663/LMG 15103 地短芽孢桿菌。

1.5.3 菌株16S rRNA基因序列分析

取培養24 h的KHQH-1菌液，使用DNA提取試劑盒提取該菌的基因組DNA。16S rRNA 基因序列PCR 擴增引物為細菌通用引物，27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′)[18]。PCR反應為25 μL體系為10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，Taq聚合酶0.2 μL，引物27F和1492R各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 17.3 μL。94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，然后4 ℃保存備用。PCR擴增產物送交上海伯杰醫療科技有限公司測序。菌株KHQH-1的16S rRNA序列測定后提交到NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)GeneBank數據庫，登錄號為MN443572，通過NCBI的在線BLAST系統與數據庫中16S rRNA序列進行比對。然后選取與目標菌株相似性較近的菌株序列，通過MEGA 7.0中的ClustalW進行同源性比對分析，并利用MEGA 7.0軟件對計算后的序列進行系統發育分析，構建系統發育樹 (N-J 法，Bootstrap重復1 000次，對于序列中的空缺部分，采用50%刪除的辦法處理)[22]。

表1 鑒定結果的概率

1.5.4 分離菌株和霉菌的拮抗試驗[19]

食品中的有益菌紅曲霉、根霉和米曲霉與分離菌株的抑菌試驗，采用點值法；食品中的有害菌黃曲霉、青霉和綠色木霉的抑菌試驗，采用濾紙片法。

1.5.5 分離菌株和細菌的拮抗試驗

分離菌株KHQH-1和細菌的拮抗試驗采用點值法，將溶化的NA培養基15～20 mL倒入無菌培養皿制成平板，平板放置30 ℃恒溫箱5 d，使培養基表面的冷凝水徹底蒸發，將活化2次的待試細菌，用接種環取2環加入9 mL無菌生理鹽水中，混勻待用；用無菌吸管取細菌懸液0.2 mL均勻涂布平板；靜止1 h，用滅菌牙簽蘸取平板上的納豆菌1次，在涂布細菌的平板上連續點種4次，接種點之間和培養皿邊緣要間隔1 cm以上距離。36 ℃恒溫培養18～72 h，培養過程中觀察抑菌情況，并測定抑菌圈大小。

1.5.6 抑菌圈大小測量方法

從平板背面分別測量抑菌圈和KHQH-1的外邊緣直徑，然后將抑菌圈直徑減去KHQH-1外邊緣直徑即為KHQH-1抑菌圈的大小。以抑菌圈數據不再變化時的大小為最終測定結果，為了避免平均值不能體現平行試驗中的偶然誤差的弊端，對平均值進行了標準差分析。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態特征分析

2.1.1 菌株群體培養特征

在固體NA平板上進行劃線后36 ℃培養，菌株KHQH-1形成菌落近似圓形，較扁平，邊緣不整齊，中間有小突起，不分泌色素。培養18 h，菌落為白色，皺褶、干燥不透明；24 h后顏色由白色轉為偏黃色(圖1)。

圖1 KHQH-1在NA平板上生長24 h之后的菌落形態

2.1.2 菌株個體形態特征

將KHQH-1轉接NA斜面試管，36 ℃恒溫培養，分別對培養8 h和24 h的菌進行革蘭氏染色，使用顯微鏡10×目鏡，100×接物鏡觀察其形態(圖2)發現，培養8 h的菌基本沒有芽孢形成，呈桿狀，菌體細長，呈深紫色，為革蘭氏陽性細菌；培養24 h之后，菌體細胞質濃縮形成芽孢，芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央，芽孢形成后，菌體變短變粗。

A-培養8 h的革蘭氏染色結果;B-培養24 h的革蘭氏染色結果

2.2 分離菌株的生化及分子鑒定結果

2.2.1 菌株的生化鑒定

由個體形態觀察可知，該菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌，選擇BCL芽孢桿菌鑒定卡。按照1.5.2.1的方法，對分離菌株KHQH-1進行生化鑒定，試驗詳情見表2，鑒定結果見表3。

根據表2的生化試驗詳情，VITEK 2鑒定結果(表3)顯示， KHQH-1在枯草芽孢桿菌/解淀粉芽孢桿菌/萎縮芽孢桿菌中的概率為94%，此為可信度非常好的鑒定?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽孢桿菌具有很近的親緣關系,致使最初人們將解淀粉芽抱桿菌稱為枯草芽抱桿菌的亞種,后來確定解淀粉芽抱桿菌是獨立的有效物種之一[20-21]。為了進一步確定分離菌株的種別，采用分子生物學鑒定方法進行驗證。

表2 菌株的生化試驗詳情

注：表中未注明編號的反應孔(1～64)為空白；帶PC計算機的VITEK? 2 Systems結果顯示為+、-、(-) 或(+)；+=95%～100% 陽性；-=0%～5% 陽性；當無法確定某結果為明確陽性或明確陰性時，如果反應稍低于閾值則顯示為弱陰性(-)，如果反應稍高于閾值則顯示為弱陽性(+)

表3 菌株的生化鑒定結果

注：相似細菌的(混合)分類群鑒定結果當所列分類群的生化譜相同時會出現這種情況

2.2.2 16S rRNA 基因序列及系統進化分析

采用試劑盒提取DNA，按1.5.3方法進行基因組PCR 擴增、測序、序列與GeneBank數據庫比對，確定該菌為芽孢桿菌屬。其中與其擬合度最高(99.75%以上)的為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，其他擬合度98%以上的細菌有絲狀芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。選取芽孢桿菌屬中與目標菌株相似性較近的菌株序列，構建系統發育樹，結果(圖3)顯示，分離菌株KHQH-1與解淀粉芽孢桿菌的親緣關系較近。

圖3 菌株 KHQH-1 系統發育進化樹

2.3 KHQH-1對霉菌和細菌的抑制作用

分別將菌株KHQH-1與霉菌和細菌進行抑菌試驗，實驗過程中定期觀察是否有拮抗現象，有拮抗現象的等到KHQH-1抑菌圈大小不再發生變化時，分別測量抑菌圈和菌落外緣的垂直直徑,并計算該菌抑菌圈的大小如表4、圖4、圖5所示。

由表4可知, KHQH-1對紅曲霉沒有抑制作用；對根霉和米曲霉均有一定抑菌作用，抑菌圈大小分別為6.30和6.43 mm，抑制效果不強，可以考慮在發酵食品和飼料中進行應用，但是要注意不同菌種使用先后順序和時間間隔；納豆菌對食品和飼料中常見的霉菌—黃曲霉、青霉和綠色木霉均有較強抑制效果，其抑菌圈大小分別為13.70、9.30和10.87 mm，抑菌圈大小可作為拮抗作用強弱的標志，抑菌圈≥9.0 mm表示抑菌能力較強[23]，可見對黃曲霉抑制效果最強，因為不存在有益菌和有害菌共同用于發酵的情況，此處選擇濾紙片法，主要用濾紙片吸收KHQH-1發酵上清液，考察其抑菌情況；納豆菌對食品中常見細菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌圈大小分別為8.20和3.20 mm，可見對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌抑制效果更好。

表4 KHQH-1對不同微生物抑菌圈大小 單位：mm

A-根霉；B-米曲霉；C-黃曲霉；D-青霉； E-綠色木霉

A-大腸桿菌；B-金黃色葡萄球菌

目前不同來源的解淀粉芽孢桿菌不斷被分離鑒定，但是其應用主要集中在作物生防方面，將其應用于食品防腐保鮮方面的研究鮮見報道。劉超等[24]研究了解淀粉芽胞桿菌BA-26 抗菌粗提物的抑菌譜,發現BA-26 抗菌粗提物對所試真菌都有十分明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均在 15.7 mm 以上；而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌沒有抑菌作用。柴慶凱等[25]將解淀粉芽孢桿菌 LJ02的粗提液應用于黃瓜灰霉病，粗提液通過噴施、灌根、注射3種施用方式的抑制率分別為 47.50%、66.23%和 49.33%。史一然等[26]研究了解淀粉芽孢桿菌LZN01對西瓜專化型尖孢鐮刀菌的抑制效應。陳照等[27]對從檳榔樹根際土壤中分離到的1株解淀粉芽孢桿菌HAB-9進行鑒定并對17種植物病原菌的拮抗作用進行試驗，其中對檳榔炭疽效果最好。楊帆等[28]篩選出拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌BA-26，該菌對所試8 種馬鈴薯病原真菌均表現出較強的拮抗作用。由此可知，本研究對從柑橘分離的解淀粉芽孢桿菌，分別對食品中有益霉菌、有害霉菌和有害細菌進行了抗菌譜實驗，得到了有價值的拮抗效果。

3 結論

近幾年關于解淀粉芽孢桿菌的研究較多，主要集中在解淀粉芽孢桿菌在動物飼料、植物病蟲害防治及作物生長調節方面的研究，而且抗菌譜方面的研究也主要集中在引起植物病害的微生物方面，然而對食品中應用的微生物及引起食品腐敗變質微生物的研究較少。本研究進行了擴大解淀粉芽孢桿菌應用范圍的嘗試，對于在食品生產及防腐方面的應用提供新的思路及參考。

前期課題組在對柑橘的防腐保鮮研究中，從柑橘上分離篩選得到1株細菌，經形態、生化和分子鑒定，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。該菌對紅曲霉沒有任何抑制效果，這與紅曲霉本身能產生抑菌物質有關。然而該解淀粉芽孢桿菌對食品中常見的霉菌具有抑制作用，對根霉和米曲霉具有一定抑制效果；對能夠產生黃曲霉毒素的黃曲霉、危害蔬果的青霉和對食用菌栽培危害嚴重的綠色木霉3種霉菌具有較強的抑制作用。該菌對使用濃度較大的革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌具有一定抑制效果，并且對革蘭氏陰性細菌大腸桿菌具有較高抑制能力。由此可見該菌具有廣譜抗菌活性。BacillusamyloliquefaciensKHQH-1的分離及鑒定豐富了抗菌微生物資源，具有潛在開發出新抗菌化合物的可能，對具體的抑菌物質分離及其結構分析鑒定有待進一步研究，將其廣譜抗菌能力應用于食品防腐保鮮、生防、飼料添加等方面的方式方法亟待進一步探索。