不同生態環境對羊肚菌揮發性物質的影響

謝麗源,許瀛引,彭衛紅,甘炳成

(四川農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都， 610066)

羊肚菌(Morchellaspp.)，隸屬子囊菌門(Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)[1]，是一種珍稀名貴食(藥)用菌，由于其菌蓋表面有不規則多面凹陷皺褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鮮美、營養豐富，含有多糖、生物酶類、鈣、鋅、鐵等多種礦物質[2-3]，具有調節機體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多種功效[4-12]。隨著羊肚菌馴化栽培技術的日趨成熟，羊肚菌種植區域越來越廣，而不同的生態條件、種植方式，以及不同的基因型品種等都是影響羊肚菌揮發性香氣成分的關鍵因素[13]，不同生態條件對揮發性香氣物質的影響在食用菌尤其羊肚菌中研究甚少。本研究采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)-氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)的方法檢測同一遺傳背景、相同配套栽培方式，在四川不同生態環境馴化栽培的羊肚菌樣品，分析不同產地羊肚菌揮發性物質組成種類和含量，并通過主成分分析和聚類分析表征生態環境對羊肚菌揮發性物質差異，旨在為不同產區樣品的辨別和評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采集不同生態環境、相同遺傳背景以及相同栽培基質和培養條件的馴化栽培羊肚菌，來源如表1所示。羊肚菌采集后經過挑選、烘干，粉碎后密封待用。

表1 樣品來源

1.2 儀器與設備

7890-5975氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，配有電子轟擊電離源(EI),美國Agilent公司；65 μmPDMS/DVB萃取纖維頭,美國Supelco公司；Teledyne Tekmar Atomx動態頂空自動進樣器,美國。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取

將粉碎后的樣品混合均勻，稱取2.00 g試樣放置在10 mL樣品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL經過煮沸冷卻的蒸餾水，搖勻，然后將溶液置于15 mL頂空瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析檢測。

1.3.2 GC-MS條件

色譜柱DB-WAX 60 m×0.25 mm×0.50 μm；載氣為高純氦氣；載氣流速(恒流模式)1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃；進樣方式為分流進樣；分流比10 ∶1；升溫程序為35 ℃，以5 ℃/min速率升溫至220℃，保持10 min；離子源溫度230 ℃；掃描模式為scan掃描模式；掃描范圍為45～350m/z；接口溫度230 ℃；

1.3.3 主體揮發性香氣成分評定方法

采用相對氣味活度值(relative odor activity value, ROVE)評價各揮發性物質對樣品總體風味的貢獻[14-16]，定義對樣品風味貢獻最大的組分的ROAV=100，則其他揮發性成分的ROAV<100，其計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ci、Ti分別為揮發性成分的相對含量(%)和氣味閾值(μg/kg);Ct、Tt分別為對樣品整體風味貢獻最大組分的相對含量(%)和氣味閾值(μg/kg)。

ROAV≥1，說明該物質為樣品的主體風味成分，且在一定范圍內，ROAV越大說明該物質對總體風味貢獻越大； 0.1≤ROAV<1，說明該物質對整體風味有修飾作用[17-18]。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0進行主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同生態環境羊肚菌干品GC-MS分析

通過GC-MS分析，揮發性物質組成及相對含量如表2所示。12個樣品共鑒定出33種揮發性物質，其中有10種醛類，8種酯類，5種醇類，6種烴類，2種酮類，1種呋喃，1種含硫化合物。從含量分析， 2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、正己醛相對含量較高；從組成分析，各樣品揮發性物質數量和含量有一定差異，其中共有物質13個，包括2-甲基丙醛、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、正己醇、己酸乙酯、苯甲醛、3,6-二甲基癸烷、萘、莰烷。研究還發現，有些揮發性物質具有一定生境特異性。如僅丘陵地區樣品含有硫化物；僅川西高原樣品含有二十烷；僅成都平原樣品含有1-辛烯-3-醇。

2.2 羊肚菌揮發性成分種類分析

由表3可知，不同生態環境樣品在揮發性物質種類和相對含量沒有明顯相關性，差異較大。醛類種類數量最多，相對含量占比最高，在37.95%～82.25%；酯、醇、烴、含硫化合物居第2大類，分別為7.31%～15.00%、3.72%～25.82%、4.08%～9.46%和9.48%～13.99%；酮、呋喃屬第3大類，分別為0.6%～1.62%和0.71%～3.29%。

表2 不同種類揮發性成分在羊肚菌中的相對含量

注：-表示未檢出(下同)

表3 羊肚菌樣品揮發性物質組成及相對含量

2.3 羊肚菌揮發性香氣成分分析

不同生態環境羊肚菌揮發性香氣成分的ROAV，如表4所示。12個樣品主體揮發香氣成分(ROAV≥1)相似，都包含有2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯，而其中風味貢獻的最大的組分為2-甲基丁醛。2-甲基丙醛具有巧克力，蜜桃味；乙酸乙酯具有果香及葡萄、櫻桃香；正己醛具有葉香、果香味；2-甲基丁醛具有果香、可可味；己酸乙酯具有強烈的甜的果香、菠蘿、香蕉香氣和酒香，這些香氣組成了羊肚菌特有的香氣。除此之外，不同生態環境樣品有特異性，如PY7、PY8和PY9主體揮發香氣成分還含有具有蘑菇香氣、青香、蔬菜香以及油膩的氣息的1-辛烯-3-醇， Q10、QL11和QL12含有具有蔬菜香的二甲基二硫化物。對整體風味起重要修飾作用的成分有一定差異。CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、PY8對整體風味起重要修飾作用的成分(0.1≤ROAV<1)為萘，CD6和PY7對整體起重要修飾作用成分是萘、2-戊基呋喃和正戊醛，萘、2-戊基呋喃和丙酸乙酯對PY9的整體風味起修飾作用，QL10和QL11起修飾作用成分為萘、2-戊基呋喃、丙酸乙酯和正戊醛，QL12起修飾作用成分為萘、2-戊基呋喃、正戊醛、戊酸乙酯和正壬醛。

表4 羊肚菌樣品揮發性成分氣味貢獻表

注：NF表示無法查到該化合物的感覺閾值而未作分析

2.4 羊肚菌揮發性物質的PCA

由表5可知，特征值大于1的共7個主成分，總方差95.381%，其方差貢獻率依次為44.971%、18.388%、9.331%、7.106%、6.376%、5.650%、3.558%，說明7個主成分反映了原始變量的絕大部分信息，成功達到了降維目的。

表5 主成分的方差貢獻率

羊肚菌非揮發性物質的主成分載荷得分圖如圖1所示。

圖1 十二個羊肚菌樣品的33種揮發性物質的3D載荷得分圖

第一主成分(PC1)中載荷較高的揮發性物質有2-戊基呋喃、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、正己醛、正己醇、己酸乙酯、正戊醛、戊酸乙酯、壬醛等。主成分1差異主要集中在青香、果香的揮發性物質。

第二主成分(PC2)中載荷較高的揮發性物質有二甲基丁酸乙酯和2-甲基-1-丁醇等。主成分2的差異主要集中在水果香、無香型的揮發性物質。

第三主成分(PC3)中載荷較高的揮發性物質有1-辛烯-3-醇和香葉基丙酮等。主成分3的差異主要集中在水果香、蔬菜香的揮發性物質。

如圖2所示，12個羊肚菌樣品可區分為三類，其中樣品Q10、Q11、Q12歸為1個集群，樣品PY7、PY8、PY9歸為1個集群，樣品CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、CD6歸為1個集群。同一個集群樣品的揮發性物質相似，有相似的香氣成分。

圖2 十二個羊肚菌樣品的主成分3D得分圖

2.5 羊肚菌揮發性物質的CA

采用系統聚類分析法，以33個羊肚菌揮發性物質作為變量進行聚類分析。由圖3可知，當刻度為10時，12個羊肚菌樣品可分為2個集群，樣品QL10、QL11、QL12聚為1個集群，剩下的9個樣品歸為1個集群；刻度為5時，9個樣品又可分為2個集群，樣品PY8、PY9、PY7為1個集群，樣品CX1、CX2、CD4、CD6、CX3、CD5歸為1個集群。CA與PCA在刻度為5時的結果一致，說明二者均可對羊肚菌樣品進行分類。通過分類結果可見，相同生境馴化栽培的樣品聚為一類，如成都平原樣品和丘陵地區樣品分別聚為一類，川西高原和川東山區樣品較為相似，聚為一類。該研究結果可為后期的樣品采集提供理論依據，從而指導后期生產加工。

圖3 羊肚菌樣品聚類分析樹狀圖

3 討論

生態環境是決定樣品代謝特征的重要因素，而揮發性香氣成分是蘑菇致香物質的主體，是影響食用菌風味的主要因素之一[23-28]。目前羊肚菌種植區域范圍廣，各產地氣候、土壤等生態環境差異大，使得香氣風格特征表現形式多樣化，體現在香氣成分主要組成的含量和比例不盡相同，尤其是某些揮發性物質具有一定的生境特異性，如川西高原樣品CX1、CX2、CX3含有二十烷；成都平原樣品PY7、PY8、PY9含有1-辛烯-3-醇；丘陵地區樣品QL10、QL11、QL12含二硫化合物。這是由于在遺傳背景一致情況下，氣候、土壤、水質等環境條件會影響揮發性物質的初級和次級代謝，使得積累的代謝產物在種類和含量存在一定差異。

揮發性化合物對香氣的貢獻是由含量和氣味閾值共同決定，相對含量高的化合物不一定對香氣的貢獻就高。不同生態環境羊肚菌樣品主體揮發性物質2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯相同情況下，不同生境條件樣品有特異性香氣，PY7、PY8、PY9因含有1-辛烯-3-醇，具有蘑菇香氣，Q10、QL11和QL12因含有二硫化合物而具有蔬菜香。除此之外，對整體風味起重要修飾作用的成分主要集中在萘、2-戊基呋喃、正戊醛、丙酸乙酯、戊酸乙酯和正壬醛，但不同生境間存在一定差異。由此可知，栽培環境條件不僅影響初級和次級代謝產物種類和含量，還會在一定程度上影響主體揮發香氣成分和對整體風味起重要修飾的成分，從而影響樣品整體風味。

從揮發性香氣成分的種類含量和主體香氣成分分析，不同生境羊肚菌樣品存在一定差異，但是無法直接通過這些數據對相似樣品進行判定、區分和聚集。進一步通過PCA和CA統計分析發現，相同生境馴化栽培樣品可以聚為1類，聚集一起的樣品香氣相似。由此說明PCA和CA可用于表征不同生境栽培馴化樣品揮發性香氣成分的差異，且2種方法可以相互檢驗。該研究結果為羊肚菌品種選育、質量評估及后期生產加工提供理論依據。