山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠的免疫調節作用

樊乃境，王冬梅，高悅，郭亞男，程天賦，房慶喜，范志軍*

1(東北農業大學，黑龍江 哈爾濱，150030)2(黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，黑龍江 佳木斯，154000)

免疫能力低下是一種暫時性或永久性免疫功能障礙狀態，并且由于免疫系統遭到破壞，機體對病原體和外界刺激更加敏感，極大地危害人體健康。因此，通過一些切實可行的措施，提高機體免疫力，增強機體免疫功能，是營養學家和醫務工作者目前面臨的且急需解決的重大課題。目前，常采用免疫增強劑進行調節機體免疫能力，如左旋咪唑、卡介苗、糖皮質激素等。但此類藥物具有毒副作用強和生產成本高的缺陷，并且大多數免疫調節藥物并不適用于慢性或預防性的用途[1]。科學家們正在積極尋求和研究天然、安全的保證身體健康以及調節人體疲勞、增強免疫力的保健功能食品。在眾多的保健功能食品研究中，蛋白肽不乏是重點研究對象之一，尤其是在水解形成多肽后的保健效果已被科學家廣泛確認。

免疫活性肽是一類能促進和激活人體免疫能力的小分子活性肽，隨著人們對免疫活性肽研究的關注和深入，其發揮免疫功效的機理和結構與功能的關系將被揭開。目前已經在臨床上將免疫活性肽研發成免疫調節劑，用于治療免疫缺陷疾病或者是自身免疫性疾病等[2-3]，具有廣闊的應用前景。目前，從谷物蛋白[4]、豆類蛋白[5]、牛奶蛋白[6]、魚蛋白[7]、小麥蛋白[8]和貝類蛋白[9]中分離的肽已用于改善免疫功能低下的動物和患者的免疫功能。研究表明，食源性免疫活性肽對特異性和非特異性免疫應答均能發揮免疫調節作用，但是關于免疫活性肽對免疫系統組織學基礎的調控作用缺乏系統的研究[2,4-7]。

山藥是一種藥食同源的食材，具有免疫調節、抗氧化、抗衰老、調節血脂血壓和體內酸堿平衡等功效[10]。目前，對山藥功能因子的研究多集中在山藥多糖和糖蛋白的提取純化[11-13]及其生物活性[14]，如分離出的糖蛋白組分CYG1和CYG2具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用[14]。但山藥蛋白質中的氨基酸種類極為豐富，含有人體所必需的8種氨基酸且占總量25.32%，氨基酸評分、化學評分、營養指數等指標也均高于大豆分離蛋白和玉米蛋白，這些均說明了山藥蛋白是一種營養價值極高的優質植物蛋白源[15]。目前關于山藥蛋白的研究較少，關于山藥蛋白肽的研究僅限于水解工藝的優化[16-18]及山藥多肽啤酒[15]的制備工藝。因此，本實驗采用隔天皮下注射環磷酰胺構建免疫能力低下小鼠模型，通過口腔灌胃低、中、高不同劑量的山藥蛋白肽，并與空白對照組、陰性對照組相比較，從機體免疫系統(免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質)進行探討山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠的免疫調節作用，以期為山藥蛋白肽免疫活性的深入研究及深度開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF(Specitic pathogen tree)級昆明種小鼠，雌雄各半，體重(25±2)g。

1.1.2 試劑

山藥蛋白肽，實驗室自制，水解度42.5%；山藥蛋白，實驗室自制，蛋白純度93.2%；鐵棍山藥，產地河南焦作；注射用環磷酰胺(cyclophos phamide，CY)，江蘇盛迪醫藥有限公司，國藥準字H32020857；鹽酸左旋咪唑片(LH)，廣西南國藥業有限公司；胎牛血清，Hyclone；DMEM培養基、胰酶，Gibco；青霉素-鏈霉素溶液，碧云天生物技術有限公司；PBS，索萊寶生物科技有限公司；LPS，Biosharp；切片用石蠟，山東寶麗來有限公司；蘇木精染色素，上海藍季科技發展有限公司；伊紅染色素，上海藍季科技發展有限公司；乳酸脫氫酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；酸性磷酸酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水碳酸鈉，汕頭市西隴化工廠有限公司；亞硝酸鈉，衡陽市凱信化工試劑有限公司；鈉石灰，上海納輝干燥試劑廠；小鼠IL-1α、IL-6、IFN-γ、IgG、IgM ELISA試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

HF-90 CO2恒溫培養箱，上海力申科學儀器有限公司；AE31倒置顯微鏡，麥克奧迪實業集團有限公司；SW-CJ-IF 型超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；MEK-7222血細胞分析儀，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；MULTISKAN MK3型酶標儀，美國Thermo公司；LEICA RM2235 石蠟切片機，德國徠卡有限公司；101-1型電熱鼓風恒溫干燥箱，上海東星建材實驗設備有限公司；BD-326型臥式冷凍冰柜，青島海爾冷凍總公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥蛋白肽的制備

山藥蛋白肽制備工藝：

山藥蛋白→加水(底物濃度為7%)→加熱處理(95 ℃、10 min)→冷卻→調 pH 10，溫度50 ℃→加7%胰蛋白酶→恒溫恒pH水解4.5 h→滅酶(95 ℃、10 min)→冷卻→調 pH 9，溫度60 ℃→加7%堿性蛋白酶→恒溫恒pH水解3 h→滅酶(95 ℃、10 min)透析脫鹽12 h→冷凍干燥→山藥蛋白肽(水解度為42.48%)

1.2.2 山藥蛋白肽的氨基酸組成分析

稱取一定質量的山藥蛋白肽置于水解管中，加入6 mol/L 10 mL鹽酸溶液，重復抽取真空充NL后封口，置于110 ℃恒溫干燥箱內水解24 h，取出冷卻后過濾，將濾液定容至50 mL，準確吸取1 mL，于50 ℃真空干燥后采用蒸餾水溶解過濾，采用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。

1.2.3 動物分組及給藥

將小鼠隨機分為6組，具體給藥方法如表1所示。每組每天灌胃(ig)給藥，連續灌胃給藥10 d，同時，除正常對照組外，其余各組隔天皮下注射(Sc)環磷酰胺制造免疫能力低下小鼠模型。

表1 動物實驗分組及給藥情況

1.2.4 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫器官的影響

1.2.4.1 體重及免疫器官指數測定

末次給藥后予小鼠禁食12 h，宰殺前進行稱體重并記錄，頸椎脫臼法處死，分別取胸腺和脾臟稱濕重，如公式(1)、公式(2)所示計算小鼠胸腺、脾臟指數:

(1)

(2)

1.2.4.2 脾臟病理學切片測定

取完好無損的同一部位脾臟用PBS緩沖液洗凈，儲存于10%中性多聚甲醛溶液中固定，橫切一塊脾臟組織，不同濃度乙醇常規脫水后石蠟包埋，切3 mm切片于溫水浴中展平，平鋪于載玻片上置于37 ℃恒溫箱過夜后在4 ℃冰箱內保存，HE染色鏡檢觀察。

1.2.5 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫細胞的影響

1.2.5.1 腹腔巨噬細胞中乳酸脫氫酶(lactic dehtdrogenase,LDH)及酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACPase)活性的測定

將小鼠脾臟器官采用4 ℃的生理鹽水沖洗干凈，置于15 mL的離心管中，并加入相當于小鼠脾臟19倍重量的生理鹽水，在4 ℃下將離心管充分勻漿，制成5%脾臟組織液，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用，按照說明書方法進行檢測LDH、ACPase酶活性。

1.2.5.2 對免疫能力低下小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

末次給藥1 h后處死動物，75%酒精浸泡5 min，無菌環境中取出脾臟，剪碎后過200目醫用紗布，收集得到脾細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，取細胞沉淀，加4 mL紅細胞裂解液吹打均勻，室溫靜置5 min后，1 000 r/min離心5 min，取沉淀采用4 mL PBS洗滌3遍，重懸中含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h，去除貼壁細胞，懸浮的細胞為脾淋巴細胞，然后按5×106/孔密度接種于6孔板進行培養。將處于對數生長期的脾細胞按照1×104/孔密度接種于96孔板，按照試驗分組進行培養12 h后，按照說明書采用WST-1法檢測細胞增殖率。

1.2.6 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫活性物質的影響

1.2.6.1 對免疫能力低下小鼠血清IL-1α、IL-6、IFN-γ含量的影響

末次給藥后，小鼠禁食12 h，小鼠眼框采取50 μL，采用ELISA法進行檢測IL-1α、IL-6、IFN-γ含量。

1.2.6.2 對免疫能力低下小鼠血清IgM、IgG含量的影響

末次給藥后，小鼠禁食12h，小鼠眼框采取50 μL，采用ELISA法進行檢測IgM、IgG含量。

1.2.7 數據處理方法

每組實驗平行測定至少3次，實驗結果表示為均值±標準差，利用SPSS軟件對數據結果進行方差分析，并采用Duncan法進行組間比較，P<0.05表示差異顯著，采用Origin 8.5 對數據結果作圖。

2 結果與分析

2.1 山藥蛋白肽的氨基酸組成分析

山藥蛋白肽的氨基酸組成分析見表2。

由表2可知，山藥蛋白肽(iron yam peptides，IYPs)的氨基酸組成中谷氨酸含量最高可達18.73%，其次是天冬氨酸和亮氨酸，且疏水性氨基酸(37.6%)和堿性氨基酸(17.6%)共占55.2%。這表明山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和極性氨基酸。

表2 山藥蛋白肽的氨基酸組成分析

2.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠體重增長率和免疫器官的影響

2.2.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠體重的影響

山藥蛋白肽對各組小鼠體重增長率的影響結果見表3。

表3 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠體重的影響

體重增長率能直接或間接反映出機體健康狀況。小鼠體重增長率的下降也是免疫能力低下模型造模成功的標志[19-20]。由表3可知，與正常組相比，其他組別的體重增長率均有不同程度的下降，這表明免疫能力低下小鼠模型構建成功；山藥蛋白肽低、中、高劑量組較陰性模型組的體重增長率均有所上升，且呈現量效關系。這說明山藥蛋白肽對CY所導致的體重下降具有一定的恢復作用，可以改善免疫能力低下引起的體重下降。

2.2.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫器官的影響

山藥蛋白肽對各組小鼠免疫器官指數的影響結果見表4。

表4 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠的免疫器官指數影響

注：*為與陰性對照組差異顯著，且P<0.05；#為與正常對照組差異顯著，且P<0.05(下同)

機體免疫器官的發育和狀態直接決定著免疫系統的應答能力[21-22]。目前，免疫器官指數是反映和評價機體免疫系統和免疫狀態的重要指標之一[23]。由表4可知，與正常組相比，模型組的胸腺指數和脾臟指數顯著下降，說明CY能抑制小鼠免疫器官的發育并誘發免疫器官發生萎縮；與CY陰性對照組相比，山藥蛋白肽低、中、高劑量組的小鼠胸腺指數和脾臟指數均有不同程度的改善，且呈現量效關系，山藥蛋白肽高劑量組和正常組的胸腺指數并無顯著性差異(P>0.05)。這表明山藥蛋白肽能明顯緩解CY構建的免疫能力低下小鼠免疫器官的萎縮，并促進其發育，增強免疫能力。

2.2.3 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟病理學切片的影響

脾臟是機體最大的淋巴器官，也是血液循環中的過濾器官，按組織結構可分為白髓和紅髓兩部分[24]。白髓是T、B淋巴細胞的集中之處，主要發揮防御外界微生物感染的作用。紅髓位于白髓周圍，由脾索和脾竇組成，能夠發揮過濾血液、清除凋亡細胞和吞噬病原體的功能[25]。脾臟發揮生物功能的基礎是完整、正常的網狀組織結構。研究結果顯示正常組脾臟結構中的紅髓和白髓的界限明顯，脾索所形成的網狀結構均勻，所圍成的脾竇分布均勻，在光鏡下無肉眼可見的病理變化；陰性對照組脾臟結構的紅髓和白髓界限消失，脾索所圍成的網狀結構遭到嚴重破壞，幾乎變成了單一的組織細胞，脾竇明顯變大；與陰性對照組相比，山藥蛋白肽低劑量組的脾臟網狀結構有所恢復，但是仍存在脾竇增大，紅髓白髓界限明顯；山藥蛋白肽中劑量組的脾臟網狀結構較為明顯，脾竇變窄，紅髓白髓界限清晰；山藥蛋白肽高劑量組的脾臟結構中紅髓白髓界限清晰，脾索所形成的網狀結構較為質密均勻，脾竇分布較為均勻。結果表明山藥蛋白肽對環磷酰胺導致的小鼠脾臟的病理變化有顯著的改善作用，并呈現量效關系。

2.3 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫細胞的影響

2.3.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響

山藥蛋白肽對小鼠腹腔巨噬細胞中LDH和ACPase酶活性的影響結果見表5。

表5 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟LDH、ACPase活性的影響

乳酸脫氫酶活性直接影響機體胞內細胞糖酵解釋放能量的速率[26]。巨噬細胞吞噬作用所需的能量也來源于糖酵解，并且LDH催化糖酵解的過程中會產生大量的乳酸,從而引起巨噬細胞胞內pH值下降，有利于巨噬細胞胞內免疫活性物質和免疫功能的應答[27]。酸性磷酸酶是高等動物巨噬細胞中溶酶體酶系的標志酶之一[28]。當外界病原體入侵機體時，巨噬細胞能發揮識別功能并啟動免疫應答機制吞噬病原體進行胞內裂解，而以ACPase為主的溶菌體酶是發揮胞內裂解的主要物質[29]。因此，LDH和ACPase酶是巨噬細胞活力的標志酶，其活性反映了巨噬細胞的活化能力和非特異性免疫水平。由表5可知，與正常組相比，陰性對照組的LDH、ACPase酶活性顯著降低(P<0.05)，表明環磷酰胺對腹腔巨噬細胞中的LDH、ACPase酶活性有顯著的抑制作用；與模型組相比，山藥蛋白肽中、高劑量組均可顯著提高脾臟中LDH酶活性(P<0.05)，并且山藥蛋白肽高劑量組的脾臟LDH酶活力和正常組無顯著性差異(P>0.05)；山藥蛋白肽高劑量組可顯著提高脾臟中ACPase酶活性(P<0.05)。結果表明山藥蛋白肽可以在一定程度上緩解免疫能力低下小鼠脾臟中LDH、ACPase酶活性的降低，提高巨噬細胞活力，從而增強免疫能力。

2.3.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠淋巴細胞增殖的影響

山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠淋巴細胞增殖能力的影響結果見圖1。

圖1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

淋巴細胞增殖是細胞免疫和體液免疫級聯反應中的重要環節。淋巴細胞的增殖能力在一定程度上反映了淋巴細胞功能的高低，也一定程度體現了機體體液免疫的能力[30]。由圖1可知，與正常組相比，CY陰性對照組的淋巴細胞增殖能力顯著下降(P<0.05)；與CY陰性對照組相比，山藥蛋白肽低、中、高劑量組可以顯著提升淋巴細胞增殖能力(P<0.05)，并且山藥蛋白肽高劑量組和正常組差異不顯著(P>0.05)。結果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導致的免疫能力低下小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的降低，且呈現量效關系。

2.4 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫活性物質的影響

2.4.1 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠白介素水平的影響

山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清白介素水平的影響結果見表6。

表6 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清白介素水平的影響

IL-1α是IL-1家族中的典型代表之一，又稱淋巴細胞活化因子，在免疫和炎癥反應及機體生長代謝方面有著不可或缺的功能[31]。IL-6是由機體多種免疫細胞產生的一種糖蛋白，主要作用的靶細胞是B淋巴細胞，又稱為B細胞刺激因子。IFN-γ是特異性免疫的調節劑，能誘導Th0型細胞分化成Th1型細胞，并且能激活巨噬細胞、細胞毒性T細胞和清除胞內病原體[32]。由表6可知，與正常組相比，CY陰性對照組的血清IL-1α、IL-6、IFN-γ均顯著下降(P<0.05)，這表明CY可引起機體白介素水平的顯著下降，降低機體免疫防御能力；與陰性對照組相比，山藥蛋白肽中、高劑量組可以顯著提升IL-1α、IL-6、IFN-γ水平(P<0.05)，且高劑量組IL-1α和IFN-γ水平和正常組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導致的免疫能力低下小鼠體內白介素水平的降低，且呈現量效關系。

2.4.2 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠免疫球蛋白的影響

表7 山藥蛋白肽對免疫能力低下小鼠血清IgG、IgM的影響

IgG是體液免疫應答所產生的主要抗體，約占血清中抗體總量的80%，具有抗菌、中和病毒及免疫調節等生物活性[33]。IgM是機體初次免疫應答中分泌最早的抗體，在抵御原發性感染的過程中發揮著重要作用[34]。由表7可知，與正常組相比，CY陰性對照組的IgG水平顯著下降(P<0.05)，這說明CY可以抑制機體IgG、IgM的分泌和表達；與CY陰性對照組相比，山藥蛋白肽低、中、高劑量組可以顯著提升IgG、IgM水平(P<0.05)，且山藥蛋白肽高劑量組IgM水平和正常組無顯著性差異(P>0.05)。結果表明山藥蛋白肽可以顯著緩解CY導致的免疫能力低下小鼠體內免疫球蛋白水平的降低，且呈現量效關系。

食源性肽的免疫活性受肽的氨基酸組成、序列、長度、電荷和結構[35]所影響。AHN[36]和HE[37]的研究表明，肽的免疫學活性與其包含豐富的疏水性氨基酸有關，這是因為疏水基團可以和細胞膜相互作用，促使其免疫活性增強，且具有免疫活性的肽末端多是堿性的氨基酸。同時VO等[38]的研究表明當肽鏈的氨基酸殘基上具有一個或多個谷氨酰胺、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸等時，能促進食源性肽的免疫調節活性。因此，疏水性氨基酸和堿性氨基酸的含量高低對免疫活性具有重要的作用。通過氨基酸組成分析發現山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和堿性氨基酸，且谷氨酸和天冬氨酸含量較高。這可能是山藥蛋白肽具有極佳免疫活性的構效原因之一。

3 結論

本課題采用隔天皮下注射CY制造免疫功能低下小鼠模型，通過口腔灌胃不同劑量的山藥蛋白肽，并與空白對照組、陰性對照組相比較，測定山藥蛋白肽的氨基酸組成及其對機體免疫系統(免疫器官、免疫細胞和免疫活性物質)的影響。結果表明，山藥蛋白肽含有極其豐富的疏水性氨基酸和堿性氨基酸；且能提高CY誘導免疫能力低下小鼠的體重生長率、免疫器官指數和改善脾臟病理學變化；提高免疫能力低下小鼠體內LDH酶、ACPase酶活性和脾臟淋巴細胞增殖能力；同時能提高免疫能力低下小鼠的細胞因子(IL-1α、IL-6、IFN-γ)和免疫球蛋白(IgG、IgM)的水平，且呈現量效關系。這表明山藥蛋白肽可以通過促進免疫能力低下小鼠的中樞和外周免疫器官的發育、改善機體免疫細胞狀態、調節體內免疫活性物質的分泌表達，提高機體免疫能力，發揮其免疫活性。