含L-精氨酸和抗氧化物質組方的毒理學安全性研究

趙燕，趙保路

1(哈爾濱工業大學(威海)生物工程系，山東 威海，264209)2(中國科學院,生物物理研究所，北京，100101)

L-精氨酸是一種非必需堿性氨基酸，主要來源于飲食、蛋白質降解和自身合成，在體內合成速度較慢，具有增強免疫力、保護胃黏膜、促進蛋白合成等生理功能[1-3]，但對于嬰幼兒為必需氨基酸，可以起到一定的解毒作用。L-精氨酸增強免疫力的重要作用機制為精氨酸—一氧化氮(nitric oxide, NO)調控模式。L-精氨酸經一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)催化生成具有生物活性的NO。NO在生物體內承擔著重要的生物功能，包括抗炎、降血壓、舒張血管等[4-7]。

天然抗氧化物劑含有大量能清除過量自由基的抗氧化成分，如山楂提取物、知母提取物、蝦青素等，具有輔助保護心血管、調節免疫、抗氧化、降血糖等功能[8-9]。山楂提取物含有黃酮、原花青素、三萜酸等抗氧化物質，具有保護心血管、抗氧化、抗炎等作用[10]，知母寧具有清熱瀉火，滋陰潤燥，退熱消炎，抑菌殺菌，降血糖等功能[11-12]。蝦青素屬類胡蘿卜素，是存在于魚、蝦和藻類中的一種強抗氧化劑，其抗氧化活性高于β-胡蘿卜素的10倍、VE的100倍[13]。

該研究重點開展了含L-精氨酸和抗氧化物質(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組方的安全性毒理學評價，以期為其臨床應用及保健食品研發提供毒理學方面的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

組方樣品由L-精氨酸(L-Arg)、山楂提取物、知母提取物和蝦青素為原料，按質量比1∶1∶2∶2制成。敵克松(dexon)，上海晶純試劑有限公司；2-氨基芴，上海晶純試劑有限公司；1,8-二羥基蒽醌，Sigma-Aldrich公司；美國胎牛血清，浙江天航科技有限公司；環磷酰胺，Sigma-Aldrich公司；Giemsa染料，salarbio公司；甲醇，天津市康科德技術有限公司；羧甲基纖維素鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BP211D電子天平、BS323S電子天平、BSA42002S電子天平，德國Sartorius公司；BX51生物顯微鏡，Olympus公司； BSC-1360ⅡA2生物安全柜，北京中聯哈爾儀器有限公司；ADVI2120i血液分析儀，西門子公司。

1.3 動物飼養和處理

SPF級雄性ICR小鼠、SD大鼠,濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,飼養于屏障級動物房，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，照明時間12 h。設毒理組和對照實驗組，分溶劑對照組和樣品低、中、高3個劑量組，每組10只動物。

1.4 劑量選擇及受試物給予方式

1.4.1 急性毒性試驗

L-精氨酸和天然抗氧化劑組方樣品,按相當于人體劑量的750倍，即20.0 g/(kg·BW)，連續經口灌胃14 d。記錄動物中毒表現和死亡情況，試驗結束后進行剖檢并記錄大體解剖結果。

1.4.2 Ames試驗

設8、40、200、1 000和5 000 mg/皿，5個劑量，稱取1.25 g樣品，加滅菌注射用水至25 mL，混勻，在0.055 MPa條件下滅菌20 min，4 ℃保存，臨用時，加滅菌注射用水按1∶4體積比依次稀釋成50 000 (不稀釋)、10 000、2 000、400、80 mg/mL，試驗時，每皿加入各個試劑組樣品0.1 mL。

1.4.3 骨髓細胞微核試驗

試驗設樣品組、溶劑對照組和陽性對照組，L-精氨酸和天然抗氧化劑組方樣品組按低、中、高3個劑量，分別為2.5、5.0和10.0 g/(kg·BW)，用5 g/L羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液配制成0.125、0.25和0.5 g/mL混懸液。陽性對照組經灌胃給予2.0 mg/mL的環磷酰胺溶液，總劑量為40.0 mg/(kg·BW)。溶劑對照組給予0.5% CMC-Na溶液。經口灌胃容積均為20 mL/(kg·BW)。

1.4.4 小鼠精子畸形試驗

試驗設樣品組、溶劑對照組和陽性對照組，L-精氨酸和天然抗氧化劑組方樣品組按低、中、高3個劑量，分別為2.5、5.0和10.0 g/(kg·BW)，用5 g/L CMC-Na溶液配制成0.125、0.25和0.5 g/mL混懸液。陽性對照組經灌胃給予2.0 mg/mL的環磷酰胺溶液，總劑量為40.0 mg/(kg·BW)。溶劑對照組給予5 g/L CMC-Na溶液。經口灌胃,給予容積均為20 mL/(kg·BW)。連續給予5 d，首次給予后第35天處死小鼠。

1.4.5 大鼠喂養試驗

30 d喂養SD大鼠組方樣品，以0.67、1.33和2.67 g/(kg·BW)(相當人體推薦量的25、50和100倍) 3個劑量摻入飼料，大鼠攝入飼養量按10 g/(100 g·BW)計，摻入質量分數分別為0.67%、1.33%和2.67%，采用逐級放大法將樣品摻入飼料中。空白對照組喂食不添加組方樣品的普通飼料。

1.5 實驗方法

1.5.1 急性毒性試驗

小鼠檢疫合格后，取試驗小鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水16 h后，經灌胃給予質量濃度為0.5 g/mL試驗樣品20 mL/(kg·BW)，1 d內給予2次，2次間隔時間4 h，每天觀察1次，觀察14 d，記錄動物中毒表現及死亡情況。試驗結束后進行剖檢并記錄大體解剖結果。

1.5.2 Ames試驗

采用平板摻入法，將冷凍保存的實驗菌株TA97、TA98、TA100、TA102分別接種于營養肉湯培養基10 mL, 37 ℃振蕩(100次/min)培養10 h。將含組氨酸(0.5 mmol/L)、生物素(0.5 mmol/L)的頂層培養基2 mL分裝于試管中，50 ℃水浴保溫，然后每管依次加入0.1 mL實驗菌株液，0.1 mL樣品溶液和S9混合液0.5 mL(需代謝活化時)，充分混勻，迅速傾入底層瓊脂板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 ℃培養箱孵育48 h，計數每皿回變菌落數。每個劑量均做3個平行板，同時設空白對照組、溶劑對照組和陽性對照組。

1.5.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

采用ICR小鼠50只，雌雄各半，雄性體重25.68～28.91 g，雌性體重26.24～29.12 g。實驗設置對照組和陽性對照組。樣品組設低、中、高3個劑量，經口灌胃，采用30 h/2次給予法，2次間隔24 h，第2次給予后6 h取材。首末給予均稱動物重量并記錄。動物頸椎脫臼法處死小鼠，取胸骨，用止血鉗擠出骨髓液與載玻片一端的胎牛血清混勻，常規涂片。空氣干燥后，用甲醇固定10 min。將固定好的涂片放入Giemsa應用液中，染色10 min，用水輕輕沖洗，涼干。在光學顯微鏡下，觀察200個嗜多染紅細胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，同時計數正染紅細胞(normochromatic erythrocyte，NCE)，計算觀察PCE/NCE比值，每只動物計數1 000個嗜多染紅細胞。觀察含有微核的嗜多染紅細胞數，微核率以千分率表示。

1.5.4 小鼠精子畸形試驗

采用ICR小鼠25只，雄性，體重25.68～28.91 g。實驗設置對照組和陽性對照組。樣品組設低、中、高3個劑量，經口灌胃，連續給予5 d，首次給予后第35 d處死小鼠。頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側附睪，放入盛有約1 mL生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪縱向剪1～2刀，靜止3 min，輕輕搖動。用4層擦鏡紙過濾，濾液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定5 min，晾干后用1%伊紅染色1 h，用水輕輕沖洗，干燥。用低倍鏡下找到背景清晰，精子重疊較少的部位，用高倍鏡檢查精子的形態。精子畸形按照無鉤、香蕉形、胖頭、無定型、雙頭、雙尾、尾折疊進行記錄。每只動物檢查1000個精子。記錄畸變的類型和數量，計算精子畸形率。

1.5.5 大鼠喂養試驗

檢疫合格后，取試驗動物L-精氨酸和天然抗氧化劑組方對人體推薦量為l.6 g/60 (kg·BW)。動物受試物毒理實驗劑量按人體推薦的25、50和100倍3個劑量摻入飼料，飼喂SD大鼠30 d。第31天后，在禁食16 h稱重。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，處死動物，取肝、脾、腎、睪丸、卵巢等臟器和胸腺稱重，計算臟/體比值；將肝、脾、腎、睪丸、卵巢等臟器固定保存好，并進行病理檢查。取血進行血液指標測定包括血紅蛋白(hemoglobin，HGB)濃度、紅細胞(red blood cell，RBC)數、白細胞(white blood cell，WBC)數、嗜中性粒細胞(neutrophils，NEU)百分率、淋巴細胞(lymphocyte，LYM)百分率、單核細胞(monocyte，MONO)百分率、酸性粒細胞(eosinophil，EOS)百分率和嗜堿性粒細胞(basophils，BASO)百分率；以血清生化指標測定包括谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、血糖(glucose，GLU)、肌酐(creatinine，CREA)、尿素(urea，UREA)、總膽固醇(total cholesterol，TCHO)和甘油三酯(triglyceride，TG)。

1.6 統計分析

采用SPSS 19.0統計軟件以X2檢驗進行數據處理，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.7 評價標準

根據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)[14]，每個劑量組與溶劑對照組分別進行比較，畸變率為溶劑對照組的2倍及以上有統計學差異，并有劑量反應關系，可判斷為實驗結果陽性。

2 結果與分析

2.1 小鼠急性毒性試驗

小鼠在觀察期內未出現死亡及中毒狀況，該組方樣品急性經口小鼠試驗最大耐受劑量(maximum tolerated doses，MTD)均>20.0 g/(kg·BW)(表1)，結果顯示該組方屬無毒級。

表1 急性毒性實驗結果

2.2 Ames試驗

如表2所示，2次試驗中組方各劑量在加和不加S9條件下各菌株回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍，各劑量組間亦無劑量反應關系。因此，在加和不加S9的條件下，組方對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102共4株菌株均未呈現遺傳毒性；即在本試驗條件下，在加與不加代謝活化系統的情況下，該組方對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陰性。

表2 Ames試驗結果

注：-表示無(下同)

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

如表3所示，組方各劑量PCE/NCE比值未少于溶劑對照組的20%，表明該組方在實驗劑量下無細胞毒性。環磷酰胺陽性對照組與溶劑對照組相比，微核率有較顯著性差異(P<0.01), 而組方各劑量組微核率與溶劑對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。因此，在該實驗條件下，該組方不會引起小鼠的骨髓嗜多染紅細胞突變作用。

表3 骨髓細胞微核試驗結果

注：**表示與溶劑對照組比較,P<0.01(雙側t檢驗)(下同)

2.4 小鼠精子畸形試驗

如表4所示，組方各劑量組小鼠精子畸形率與溶劑對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。環磷酰胺陽性對照組與溶劑對照組相比，有較顯著性差異(P<0.01),因此，在該實驗條件下，該組方對小鼠精子畸形試驗結果為陰性。

表4 小鼠精子畸形試驗結果

2.5 大鼠30 d喂養試驗

L-精氨酸和天然抗氧化劑組方按人體推薦量的25、50和100倍3個劑量摻入飼料，飼喂SD大鼠30 d，未發現與對照有顯著改變。30 d后處死動物，取肝、脾、腎、睪丸、卵巢等臟器和胸腺稱重。如表5和表6所示，3個劑量組動物的體重以及臟器/體重比值與對照組動物相比均無顯著性差異。對肝、脾、腎、睪丸和卵巢等臟器進行病理檢查也未發現顯著的病理變化。對血液學檢查結果和血清生化指標檢查結果如表7和表8所示。與對照組比較，血清生化可見雄性動物低、高劑量組ALB顯著降低，P<0.01和P<0.05；可見雄性動物低、中、高劑量組CREA顯著降低，P<0.01；可見雌性動物低、高劑量組ALB顯著降低，P<0.01和P<0.05；上述指標均在本單位正常值范圍內，可認為不存在生物學意義。其他各項指標均與對照組沒有明顯不同。綜上，該組方喂養30 d各項觀察指標未見明顯毒性作用。

表5 大鼠體重

表6 大鼠臟器/體重比值

3 討論

L-精氨酸具有調節免疫、促進蛋白質合成、保護胃黏膜等多種獨特的生理和藥理功能，在臨床營養治療中發揮著重要作用[1-3]。山楂提取物、知母提取物、蝦青素等天然抗氧化物劑，含有大量能清除過量自由基的抗氧化成分，具有輔助保護心血管、降血壓、降血脂、降血糖以及抑制神經退行性疾病等功能[15-16]。

本組方由L-精氨酸和天然抗氧化物質(山楂提取物、知母提取物和蝦青素)組成，本實驗按《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)對該組方的毒理學進行評價。研究結果顯示，該組方對小鼠急性毒性試驗中的MTD值>20.0 g/(kg·BW)，依據急性毒性分級標準，該組方屬于無毒級。小鼠Aems試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗均未發現該組方樣品有致突變作用。按人體推薦量的25、 50和100倍3個劑量，飼喂SD大鼠30 d，各組動物生長發育良好，體重、臟器重量、臟器系數、血液學檢查結果和血清生化指標等均未見異常。

表7 大鼠血液學檢查結果

表8 大鼠血清生化指標檢查結果

綜上，本實驗結果表明該組方是安全的，為其進一步開發健康食品及藥品提供了毒理學方面的科學依據。