雙歧桿菌微膠囊的制備及其理化性能

李作美， 許曉云，劉琦

1(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠,233030)2(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)院，安徽 合肥, 230000)

益生菌(Probiotics)是一類對宿主有益的活性微生物，它黏附于生物腸道內(nèi)，在與有害菌進(jìn)行營養(yǎng)競爭的同時形成占位效應(yīng)，可減少有害菌的定植[1-2]。其主要應(yīng)用于食品、藥品及保健品等領(lǐng)域，除可調(diào)節(jié)人體健康外，還可應(yīng)用于動物體內(nèi)，在提高產(chǎn)量、減少病死率等方面發(fā)揮著重要的作用[3-4]。

雙歧桿菌常見于健康人體和暖血動物腸道內(nèi)，可作為腸道益生菌單獨使用，也可和其他益生菌復(fù)合使用，是一種具備多種生理活性、在開發(fā)益生菌產(chǎn)品方面具有巨大的潛力[5]。在食品行業(yè)中，雙歧桿菌主要用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)[6]。在藥品保健品行業(yè)中，主要是制作成微膠囊，李來酉[7]將包括雙歧桿菌在內(nèi)的3種菌包埋，制作出了性能良好、儲存性質(zhì)穩(wěn)定的三聯(lián)菌微膠囊。另外雙歧桿菌在家畜養(yǎng)殖方面也能發(fā)揮一定的作用，BARBA等[8]發(fā)現(xiàn)，給仔豬喂食含長雙歧桿菌和乳雙歧桿菌的微膠囊后，其采食量和絨毛/隱窩的比率及回腸乙酸濃度大大提高，因腸道不適而表現(xiàn)出的異常反應(yīng)也有所改善。

雙歧桿菌的生理活性需定植于腸道中才能被發(fā)揮出來，但雙歧桿菌對酸、氧環(huán)境極為敏感，環(huán)境因素對其的影響是不可避免的[9]。因此，國內(nèi)外多將雙歧桿菌微囊化以降低其死亡率，這已成為雙歧桿菌應(yīng)用研究的重要方向[10-11]。合理運用微膠囊技術(shù)和壁材，可提高包埋率與穩(wěn)定性，也可將微膠囊的粒徑控制在一個合適的范圍內(nèi)[12-13]。

乳化法和擠壓法在微膠囊實驗領(lǐng)域應(yīng)用較多[14]。乳化法因鈣離子分布范圍、擴(kuò)散距離和通過液相的不同而分為內(nèi)源乳化法和外源乳化法，常和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合[15]。有研究表明前者的包埋性能要優(yōu)于后者[16]，且內(nèi)源乳化法制備出的微膠囊較外源乳化法來說球形度高、凹凸率低[17-18]。

微膠囊壁材種類繁多，性質(zhì)各異，在壁材液中添加海藻酸鈉，可提高雙歧桿菌微膠囊在人工模擬消化液中的穩(wěn)定性[19]，在對其進(jìn)行理化性質(zhì)檢測時表現(xiàn)出了良好的腸溶性[20]。以乳清蛋白作為壁材可提高微膠囊的緩沖能力[21]，還可作為菌種的凍干保護(hù)劑，提高菌在冷凍干燥過程中的存活率[22]。可在酸性環(huán)境下與海藻酸鈉發(fā)生靜電反應(yīng)，彌補(bǔ)其大孔結(jié)構(gòu)，這樣更容易攔截菌體并使菌體嵌合[23]。

本實驗采用內(nèi)源乳化法，旨在優(yōu)化雙歧桿菌微膠囊的制備工藝，以得到包埋率較高的濕膠囊和干膠囊；同時考察了濕膠囊和干膠囊在經(jīng)過人工模擬消化液及消化道體系后的穩(wěn)定性，為后續(xù)相關(guān)生產(chǎn)或研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalsssp. Lactis)，北京川秀有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基，杭州百思生物科技有限公司。

1.3 試劑與儀器

海藻酸鈉、低聚果糖、乳清蛋白、CaCO3、Span-80、冰醋酸、乙酸鈉、NaCl、MRS培養(yǎng)基、PBS粉劑、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸、HCl、胃蛋白酶、KH2PO4、胰蛋白酶、膽鹽等均為分析純，北京化工有限公司。

CVC FD8-5真空冷凍干燥機(jī)，Gold SIM International Group CO,LTD；H4-20KR臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；LRH-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；ZNCL-T 250磁力攪拌器，鞏義市子華儀器有限公司；JH-11-09可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.4 雙歧桿菌微膠囊的制備及單因素實驗

1.4.1 實驗材料的預(yù)處理

菌懸液的制備：將長雙歧桿菌菌種活化后進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，在MRS培養(yǎng)基中加入半胱氨酸鹽酸鹽37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，37 ℃下4 500 r/min離心15 min，收集菌泥，加入少量生理鹽水混合均勻。進(jìn)行梯度稀釋，接著用平板計數(shù)法輔以血球板計數(shù)法檢測菌懸液的活菌數(shù)，保證活菌數(shù)為109～1010CFU/mL，最后將稀釋到合適梯度的雙歧桿菌置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

壁材液的制備：將一定質(zhì)量的海藻酸鈉和乳清蛋白均勻混合于質(zhì)量為10 g的pH 6.5的無菌PBS緩沖液中，在紫外燈下照射30 min，放置在無菌操作臺備用。

芯材液的制備：將低聚果糖溶解在無菌水中制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%的溶液，再將其與菌懸液按體積比1∶1混合，放置備用。

1.4.2 主要溶液的配制

0.9%生理鹽水：稱取0.9 g NaCl，溶解在少量無菌水中，定容至100 mL。

醋酸溶液：取冰醋酸11.55 mL，加無菌水定容至1 L。

醋酸鹽溶液：稱取27.22 g的乙酸鈉，加少量無菌水溶解后定容至1 L，用配制好的醋酸溶液調(diào)pH至5.5。

解囊液: 稱取為35.8 g Na2HPO4·12H2O和10.5 g的檸檬酸，加純凈水定容至1 L，攪拌使之充分溶解，調(diào)pH為7.25，121 ℃高壓滅菌20 min。

人工模擬胃液：取0.1 mol/L稀HCl溶液16.4 mL，先加適量無菌水溶解，再加胃蛋白酶10 g，最后定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為1.2，過0.22 μm濾膜除菌備用。

人工模擬膽鹽溶液：取10 g膽鹽溶于無菌水中定容至1 L，過0.22 μm濾膜除菌備用。

人工模擬腸液：稱取KH2PO46.8 g，先加適量無菌水溶解；同時在另一燒杯中稱取胰蛋白酶10 g，加適量無菌水使之溶解。將兩液混合后，加無菌水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.4，過0.22 μm濾膜除菌備用。

1.4.3 雙歧桿菌微膠囊的制備方法

內(nèi)源乳化法制備微膠囊的過程參照鄧玉娣等[24]、張國芳等[25]報道的方法, 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改：將濃度不低于109CFU/mL的菌懸液與等體積的低聚果糖溶液混合均勻，制成芯材溶液，取與芯材溶液體積相同的壁材溶液，將其加入芯材溶液緩慢攪拌使之均相；將CaCO3粉末均勻地分散到該混合溶液中，然后再將此混合液乳化到含有體積分?jǐn)?shù)1.0%的Span-80大豆油中(轉(zhuǎn)速為400 r/min)，15 min后，加入冰醋酸繼續(xù)攪拌，以促進(jìn)冰醋酸和CaCO3的接觸反應(yīng)；30 min后，再加入60 mL醋酸鹽溶液(調(diào)pH為5.5)，緩慢攪拌，靜置約2 h，離心去油，收集微膠囊，生理鹽水洗滌3次后4 ℃冰箱保存；取最優(yōu)條件下的到的濕膠囊，先于-20 ℃預(yù)凍12 h，然后放入-60 ℃真空冷凍干燥機(jī)于冷凍干燥48 h，得到的凍干微膠囊-20 ℃保存[25]。

以下單因素試驗按1.4.1的標(biāo)準(zhǔn)將備用的壁材液和芯材液混合，按1.4.3的步驟在5個100 mL燒杯中進(jìn)行水相的均勻分散，在5個500 mL燒杯中完成油相的攪拌，接著進(jìn)行后續(xù)的操作。

1.4.3.1 海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對濕膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)為1%、2%、3%、4%、5%，其余因素分別為m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得海藻酸鈉的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.3.2m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)分別設(shè)為5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5，其余因素分別為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相):V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得乳清蛋白和海藻酸鈉的最適質(zhì)量比。

1.4.3.3m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)分別設(shè)為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，其余因素分別為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，V(水相)∶V(油相)=1∶3，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得CaCO3和海藻酸鈉的最適質(zhì)量比。

1.4.3.4V(水相)∶V(油相)對濕膠囊包埋率的影響

V(水相)∶V(油相)分別設(shè)為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7，其余因素分別為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，冰醋酸體積為400 μL。測濕膠囊的包埋率，獲得水相和油相的最適體積比。

1.4.3.5 冰醋酸體積對濕膠囊包埋率的影響

冰醋酸體積分別設(shè)為200、400、600、800、1 000 μL，其余因素分別為海藻酸鈉濃度為2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=1∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=1∶3。測濕膠囊的包埋率，獲得冰醋酸的最適體積。

1.4.4 總菌數(shù)與包埋率的計算

1.4.4.1 總菌數(shù)的計算公式

總菌數(shù)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，5個中方格的總菌數(shù)；B，稀釋倍數(shù)。

1.4.4.2 包埋產(chǎn)率的計算公式

包埋產(chǎn)率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：G1，1 mL解囊液中的雙歧桿菌活菌數(shù)，CFU/mL；V1，解囊液的總體積，mL；N0，包埋前單位體積原菌液中的活菌數(shù)，CFU/mL；V0，制備微膠囊所用原菌液的體積，mL；M，所得微膠囊的總質(zhì)量，g；M0，稱取微膠囊的質(zhì)量，g。

1.5 響應(yīng)面試驗的因素和水平

比較單因素試驗中這5個因素對濕微膠囊包埋率的影響程度，選取3個影響程度較大的因素，以包埋率為響應(yīng)值，使用響應(yīng)面軟件進(jìn)行3因素3水平試驗，根據(jù)結(jié)果確定最優(yōu)的雙歧桿菌微膠囊制備工藝條件。因素水平表如下表1所示。

表1 因素水平表

1.6 驗證試驗

為進(jìn)一步考察軟件得出結(jié)果的真實性，在以上得出的最佳條件下進(jìn)行試驗，接著測定雙歧桿菌濕潤微膠囊的包埋率。將試驗結(jié)果與軟件數(shù)學(xué)結(jié)果相比較，觀察差別是否明顯，試驗是否具有代表性。

1.7 雙歧桿菌濕、干膠囊的理化性能的測定

1.7.1 表征分析

將藥匙煮沸且用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒后置于紫外燈下通風(fēng)30 min，取最佳工藝條件下制得的濕潤微膠囊與凍干微膠囊，描述粒徑大小和形態(tài)特征。

1.7.2 耐胃酸實驗

取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌濕膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和1.4.1保存的菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬胃液中，37 ℃恒溫?fù)u晃0、1、2 h后，棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數(shù)。

1.7.3 耐膽鹽實驗

取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬膽鹽溶液中，37 ℃水浴0、1、2、3 h后棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數(shù)。

1.7.4 腸道釋放性實驗

取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于9 mL人工模擬腸液中，放在恒溫?fù)u床中。將其溫度調(diào)節(jié)為37 ℃，搖速設(shè)置成210 r/min，0、30、60、90 min后，直接吸取3～4 mL溶液，在波長600 nm處測吸光度。

1.7.5 模擬消化道體系實驗

取最優(yōu)條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g、凍干微膠囊0.1 g和菌懸液1 mL，分別置于人工模擬胃液中處理1 h，然后轉(zhuǎn)移至人工模擬膽鹽溶液中處理30 min，最后將各實驗組置于人工模擬腸液中處理45 min，棄去溶液(菌懸液不必棄去溶液)。收集微膠囊，用解囊液徹底崩解后，制成菌懸液，計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗的結(jié)果與分析

2.1.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對濕膠囊包埋率的影響

由圖1可知，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%升至2%時，雙歧桿菌微膠囊的包埋率提高了約10%，后又逐漸下降。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)<2%時包埋率較低，原因是此時形成的囊壁較薄，機(jī)械強(qiáng)度較弱，微膠囊容易破裂導(dǎo)致菌體流出[26]；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)>2%時包埋率緩慢下降，這是因為隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，壁材液密度和黏度也變大，不利于菌體的分散和包埋[27]。綜上所述，海藻酸鈉的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.2 乳清蛋白與海藻酸鈉的比值對濕膠囊包埋率的影響

由圖2可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率先急劇增大，后又急劇減小，當(dāng)m(乳清蛋白):m(海藻酸鈉)為1∶1時包埋率達(dá)到最大值。當(dāng)二者質(zhì)量比值較大時，乳清蛋白較多，形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)過大、過于疏松，且粘連度較高，不利于形成規(guī)格一致的微膠囊；當(dāng)二者質(zhì)量比值較小時，乳清蛋白在溶液中含量太低，與Ca2+和海藻酸鈉交聯(lián)程度均不足，雙歧桿菌包埋得不充分[28]。乳清蛋白與海藻酸鈉復(fù)配作為雙歧桿菌微膠囊壁材，當(dāng)pH值低于乳清蛋白的等電點時，乳清蛋白的靜電荷為正，與帶負(fù)電荷的海藻酸鈉多糖產(chǎn)生靜電相互作用，從而形成牢固的微膠囊膜結(jié)構(gòu)，可對雙歧桿菌提供一定程度的保護(hù)作用。綜上所述，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)最適為1∶1。

圖2 m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.3m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對濕膠囊包埋率的影響

由圖3可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率先急劇增大，后逐漸下降，當(dāng)m碳酸鈣∶m海藻酸鈉為1∶2時微膠囊的包埋率最大。CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大時，與海藻酸鈉及乳清蛋白的結(jié)合位點較多，因此包埋率會有一個飛躍過程；m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)<1∶2時，隨著碳酸鈣質(zhì)量的增大，溶液滲透壓不斷上升，這可能會對整個微膠囊體系造成損傷，使得包埋率降低。綜上所述，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)最適為1∶2。

圖3 m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.4V(水相)∶V(油相)對濕膠囊包埋率的影響

由圖4可知，雙歧桿菌微膠囊的包埋率呈先出增大、后減小、最后趨于平緩的趨勢，當(dāng)V(水相)∶V(油相)為1∶3時微膠囊的包埋率最大。分析可能是大豆油體積較小時，微膠囊之間摩擦力較大，表面不平整，影響包埋率；而當(dāng)大豆油體積過大時，摩擦力減小，無法均勻菌體和壁材液，且會造成微膠囊粒徑過大的現(xiàn)象，因此包埋率也會降低。綜上所述，V(水相)∶V(油相)最適為1∶3。

圖4 V(水相)∶V(油相)對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.1.5 冰醋酸體積對濕膠囊包埋率的影響

由圖5可知，隨著冰醋酸體積的增加，雙歧桿菌微膠囊的包埋率浮動很小，當(dāng)冰醋酸體積為400 μL時包埋率最大。可能是因為微量的冰醋酸即可引發(fā)CaCO3的解離，但當(dāng)體積<400 μL時，還有部分碳酸鈣未被解離，這就造成了包埋率偏低；當(dāng)冰醋酸繼續(xù)增加時，溶液的pH降低，對微膠囊囊壁造成輕微的影響，間接影響了包埋率。綜上所述，冰醋酸的最適體積為400 μL。

圖5 冰醋酸體積對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗優(yōu)化的結(jié)果

用Design-Expert.8.0軟件處理表2中的數(shù)據(jù)，得回歸方程：R1=79.5-0.98A+0.84B+1.63C-0.61AB+3.5AC-2.39BC-2.19A2-0.96B2-3.56C2。所得回歸方程方差分析如表3所示。

2.2.2 響應(yīng)面試驗交互作用分析

運用 Design-Expert.8.0 軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行模型圖分析，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)，V(水相)∶V(油相)與包埋率之間的相互作用，結(jié)果表明各因素對雙歧桿菌微膠囊包埋率的影響程度為V(水相)∶V(油相)>m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉) >m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)。

表2 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.2.3 驗證試驗結(jié)果

通過軟件優(yōu)化數(shù)值分析得出雙歧桿菌微膠囊制備的最佳工藝，為方便操作，將其修正成m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)= 2∶1，m(CaCO3)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=2∶5。理論上雙歧桿菌微膠囊包埋率可達(dá)80.15%，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，平行3次。實際得到的雙歧桿菌微膠囊包埋率為80.11%，與最佳提取工藝的理論值差別較小，說明該模型優(yōu)化的最佳提取工藝具有較高的應(yīng)用價值。

2.3 雙歧桿菌濕、干膠囊理化性能的測定

2.3.1 表征分析結(jié)果

最優(yōu)條件下濕膠囊為不透明微黃色顆粒狀，用顯微鏡觀察干膠囊的表面，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)皺縮狀態(tài)，且因其粒徑較小和保存不完善而造成輕微的粘連；將濕膠囊分散到無菌生理鹽水中可發(fā)現(xiàn)其形態(tài)圓潤、大小較為均一。單因素試驗時發(fā)現(xiàn)直徑約為2.8 cm的攪拌子制作出的微膠囊粒徑均一性差，分析可能是由于其直徑較小而使得攪拌時作用力弱；后續(xù)實驗均采用直徑約3.5 cm的攪拌子，此問題得以改善。

2.3.2 耐胃酸實驗結(jié)果

如圖6所示，未被包埋的菌懸液被模擬胃液侵蝕1 h后，其活菌數(shù)迅速下降至國際標(biāo)準(zhǔn)以下，放置2 h后再測量其活菌數(shù)，又下降了3個對數(shù)級，菌活力幾乎喪失殆盡。濕潤微膠囊和凍干微膠囊的活菌數(shù)也出現(xiàn)下降，但幅度較小，2 h后活菌數(shù)仍在1×106CFU/mL以上，說明此微膠囊性能良好，對胃酸有一定的抵御能力。濕潤微膠囊活菌數(shù)的下降幅度略小于凍干微膠囊，這可能是因為凍干微膠囊的囊壁在凍干后皺縮，影響了微膠囊的囊壁結(jié)構(gòu)。

圖6 菌懸液和微膠囊在人工模擬胃液中活菌數(shù)的變化

2.3.3 耐膽鹽實驗結(jié)果

如圖7所示，菌懸液、濕潤微膠囊和凍干微膠囊在模擬膽鹽溶液中37 ℃水浴3 h后活菌數(shù)均有所下降。其中菌懸液中活菌數(shù)下降的最多，濕潤微膠囊次之，凍干微膠囊最少。這是因為微膠囊的囊壁緩沖了膽鹽對菌體的傷害，且凍干微膠囊溫度較低。此外，三者在膽鹽的作用下活菌數(shù)下降均不顯著，這可能是因為膽鹽主要起分解脂肪的作用，雙歧桿菌菌體和微膠囊壁材對其并不敏感。

圖7 菌懸液和微膠囊在人工模擬胃液膽鹽溶液中活菌數(shù)的變化

2.3.4 腸道釋放性實驗結(jié)果

如圖8所示，菌懸液的吸光度隨著時間的增加，變化不明顯，濕潤微膠囊和凍干微膠囊30～60 min內(nèi)吸光度有個飛躍過程。分析可能是菌懸液從始至終一直未改變液體狀態(tài)，所以吸光度沒有明顯的變化，后期有輕微的上浮是因為菌體破裂，內(nèi)容物釋放。凍干微膠囊前期的漲幅沒有濕潤微膠囊大，可能是因為它相較于濕膠囊來說有一個吸水膨脹崩解過程。由吸光度的變化情況可得，濕膠囊與人工模擬腸液接觸60 min，干膠囊接觸90 min后大部分菌體可被釋放。

圖8 菌懸液和微膠囊在人工模擬腸液中活菌數(shù)的變化

2.3.5 模擬消化道體系實驗結(jié)果

如圖9所示，在經(jīng)過模擬消化道體系實驗后，菌懸液、濕潤微膠囊以及凍干微膠囊的活菌數(shù)都有較大的損失。但濕潤微膠囊和凍干微膠囊的最終活菌數(shù)均已達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)。冷凍干燥過程會對菌體和微膠囊結(jié)構(gòu)造成不可逆的損傷，實際生產(chǎn)中可考慮添加多種凍干保護(hù)劑，復(fù)配使用，以減弱低溫帶來的傷害。

圖9 菌懸液和微膠囊在人工模擬消化道體系中活菌數(shù)的變化

3 結(jié)論

本文采用內(nèi)源乳化法制作雙歧桿菌微膠囊。通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化了其制備工藝，以包埋率為評價指標(biāo)，得出雙歧桿菌微膠囊的最佳工藝配比為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，m(乳清蛋白)∶m(海藻酸鈉)=2∶1，m(碳酸鈣)∶m(海藻酸鈉)=1∶2，V(水相)∶V(油相)=2∶5，冰醋酸400 μL，雙歧桿菌微膠囊包埋率可達(dá)80.15%。進(jìn)行驗證試驗，制作出雙歧桿菌濕潤微膠囊包埋率為80.11%，說明相關(guān)數(shù)據(jù)具有代表性，該實驗的最佳條件有較高的應(yīng)用價值。

本文還對雙歧桿菌濕潤微膠囊和凍干微膠囊進(jìn)行耐胃酸、膽鹽、腸道釋放性和消化道體系實驗，以雙歧桿菌菌懸液為對照組。結(jié)果表明，游離的雙歧桿菌在模擬人體消化液的作用下有較高的死亡率，而制作出的雙歧桿菌濕潤微膠囊和凍干微膠囊的理化性能指標(biāo)均達(dá)標(biāo)，體現(xiàn)了對不利環(huán)境的良好耐受性，為今后益生菌產(chǎn)品的開發(fā)和相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。