米酸湯發酵工藝優化及貯存穩定性預測模型

王容，趙良忠，莫鑫，庾坤，車麗娜，劉婷

(邵陽學院 食品與化學工程學院，豆制品加工技術湖南省應用基礎研究基地，湖南省果蔬清潔加工工程技術研究中心，湖南 邵陽, 422000)

“米酸湯”是貴州苗、侗民族的傳統食品，可直接作為飲料，加入火鍋中可以改善適口性和風味[1]。目前大多數研究停留在米酸湯的初級配方上，存在發酵耗時長、產酸低，質量不穩定等諸多弊端[2-5]。因此，研制出發酵周期短、產酸高、質量穩定的米酸湯對豐富調味品品種、增加其營養價值，同時改善米酸湯單一口味和提高產品附加值等具有重要意義[6-8]。

食品在貯藏過程中的品質變化可通過化學動力學模型表達[9]。李明[10]研究了果汁型豆酸湯飲料穩定性動力學模型；RUSTOM等[11]研究了超高溫滅菌花生奶貯藏期品質變化和貯存穩定性的關系。趙慧[12]研究了復合菌發酵米乳飲料的配方優化及其貯藏品質變化；目前雖有少部分對米酸湯或米乳飲料在貯藏期間品質變化的研究，但其貯存穩定性的預測研究鮮見報道。

本文以米漿糖化液為原料，鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌、植物乳桿菌為混合發酵菌，先通過單因素實驗和響應面分析法，確定米酸湯發酵的最佳工藝條件，為生產設計提供了良好的技術支持，有一定實用價值。再以自制米酸湯為研究對象，采用貯藏期加速實驗的方法，研究在不同溫度條件下，米酸湯在貯藏過程中理化指標與感官評價之間的相關性、理化指標與貯藏時間之間的關系，獲得其化學反應動力學和熱力學參數，并建立化學動力學和熱力學快速預測模型，為米酸湯穩定性快速預測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosusstrain)、玉米乳桿菌(Lactobacilluszeaestrain)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumstrain)，湖南省果蔬清潔加工重點實驗室提供；粳米、糯米，市售；液化酶(酶活4 000 U/g)、糖化酶(酶活120 000 U/g)，百斯杰公司提供；其他化學試劑均為分析純。

SW-CJ-2FD超凈工作臺，康恒儀器公司；GI54DWS滅菌鍋，長沙艾迪生物科技有限公司；DH-360恒溫培養箱、VELOCITY18R臺式冷凍離心機，北京海天友臣科技有限公司；CR-400色彩色差計，常州三豐儀器科技有限公司；NDJ-5S旋轉黏度計、WJL-628激光粒度儀，無錫杰博儀器科技有限公司；電子鼻和電子舌，湖南弘林科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米酸湯制作工藝流程

米酸湯制作工藝流程如下：

糯米→浸泡→膠體磨磨碎→糊化→液化→糖化→滅菌→接種→培養→殺菌→成品

1.2.2 操作要點

浸泡：稱取m(粳米)∶m(糯米)=2 ∶1共100 g，凈水洗滌1～2次，在室溫25 ℃左右浸泡約6 h。

液化：在溫度降為85 ℃時，調pH值到6.5，添加1%(質量分數)的液化酶，液化25 min。

糖化：在溫度降為55 ℃時，調pH值到4.0時，添加0.02%(質量分數)的糖化酶，糖化1 h。

滅菌：105 ℃、8 min進行滅菌。

接種：通過前期預實驗在本實驗室已篩選、分離、鑒定的6珠乳酸菌條件下，進行單株發酵米酸湯實驗，選擇發酵產酸最高，而且感官評分較高的乳酸菌為鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌、植物乳桿菌，然后再通過不同組合配比優化實驗，研究出鼠李糖乳桿菌、玉米乳桿菌、植物乳桿菌最佳比例為1∶1∶1。

殺菌：酸湯發酵完全后95 ℃，15 min進行滅菌。

1.3 米酸湯發酵的工藝

1.3.1 單因素實驗

通過單因素變量法，以總酸和感官評分為評價指標，分別確定最佳發酵時間(92、96、100、104、108 h)、菌種接種量(3%、4%、5%、6%、7%)、發酵溫度(30、33、36、39、42 ℃)、初始pH(5.8、6.2、6.6、7、7.4)。

1.3.2 響應面實驗

在單因素試驗基礎上，以發酵時間、發酵溫度、pH值、菌種接種量為響應因素，以總酸為評價值，采用Box-Behnken設計原理進行4因素3水平響應面分析試驗。

1.4 米酸湯貯存穩定性研究[13-14]

1.4.1 貯藏期間理化參數動力學與熱力學[15]

貯藏期間品質理化參數的變化如公式(1)所示：

(1)

式中：C，t時的物化參數值；K，反應速率常數；n，反應級數。

貯藏時間與反應溫度有關的變化，用Arrhenius方程計算，如公式(2)所示：

(2)

式中：A0，Arrhenius常數；Ea，活化能(kJ/mol)；R，絕對氣體常數(8.314 J/mol)；T，絕對溫度(0K)。

為了更深入反應機理,根據絕對反應速率理論可以計算反應熱力學參數，ΔH*、ΔS*、ΔG*,如公式(3)～公式(5)所示：

ΔH*/(kJ·mol-1)=Ea-RT

(3)

(4)

ΔG*/(kJ·mol-1)=ΔH-TΔS*

(5)

式中：ΔS*，J/mol°K；Kb，Boltzmann常數(1.38×10-23J/0K)；h，Plank常數(6.626×10-31J·s)。

1.4.2 米酸湯快速貯藏實驗[16]

以自制的米酸湯為樣品進行貯存穩定性試驗, 依照Arrhenius方程, 將樣品分別放入25、35、45 ℃的恒溫箱中保存。樣品測定時間為從第1天開始, 間隔10 d測定1次直到第90天，檢測時每個溫度處理隨機取3袋平行樣進行檢測。初步將感官評分低于60分時設為產品貯存穩定性終點, 然后對試驗數據進行統計分析, 再按上述原理預測出自制米酸湯的貯存穩定性。測試內容包括離心沉淀率、粒徑、黏度、色差值、pH值、感官評分。

1.5 米酸湯理化指標測定

1.5.1 總酸含量測

參照GBT 12456—2008食品中總酸的測定[17]。

1.5.2 離心沉淀率[18]

稱量20 g樣品放入離心管中，設定離心機參數為4 ℃、10 000 r/min、15 min。離心結束后，倒立靜置5 min瀝干后稱量，進行3次平行測定，離心沉淀率取平均值。

1.5.3 色差值[19]

用移液槍準確移取混勻的米酸湯2 mL， 以蒸溜水為對照，測定米酸湯的L*、a*、b*值 然后按照下式求出 ΔE值，ΔE越大表示樣品顏色差異越大,如公式(6)所示：

(6)

1.5.4 黏度測定

量取20 mL米酸湯，采用NDJ-5S旋轉黏度計進行測試。

1.5.5 感官評定

由20名有經驗的酸湯評品員，分別對米酸湯的4個組分進行評定，采用百分制，具體的感官評價標準見表1。

表1 米酸湯感官評定指標

1.6 電子鼻及電子舌測定風味物質[20]

量取15 mL米酸湯，采用電子鼻、電子舌進行測試。每個樣品平行測定5次。

1.7 數據處理

運用IBM SPSS Statistics 22軟件進行數據處理分析，且每組實驗重復3次(結果均以平均值±標準差表示)與相關性分析，應用Origin 9畫圖。

2 結果與分析

2.1 米酸湯單因素試驗

由圖1-a可知，在P<0.01時，發酵酸度與發酵時間pearson相關系數為0.973，呈極正相關。在發酵的前100 h，總酸增長速率較快，有顯著性，在發酵100 h之后，總酸增長緩慢，沒有顯著性差異，但隨著發酵的不斷進行，發酵菌產總酸不斷積累，發酵液的pH也隨之降低，由于高濃度總酸的反饋抑制，發酵菌的生長繁殖受到抑制，米酸湯的口感也出現了下降的趨勢。綜上所述，100 h為最優發酵時間。

由圖1-b可知，發酵菌均是乳酸菌耐熱性差的微生物。溫度較低時抑制發酵菌中一些酶的活性，其生長繁殖能力差，產酸能力弱，導致酸度不高；溫度過高時，發酵菌中一些不耐高溫的酶將會失活，一些生理生化活性喪失，從而也會影響米酸湯的總酸和風味。綜上所述，36 ℃為米酸湯的最佳發酵溫度。

由圖1-c可知，隨著pH值的增加，總酸先增大后減小。由于本實驗混合菌均為乳酸菌，pH較高或較低時都會抑制其生長繁殖，而pH 6.6時，適宜其生長繁殖，發酵菌產酸高，所以產品的酸度也高。但是隨著pH的增大或減小，發酵菌的生長繁殖過程被抑制，發酵效果不理想，酸度降低，而且感官性能也受到一定的影響。綜上所述，pH值為6.6時最佳。

由圖1-d可知，隨著菌種接種量的增加，米酸湯的酸度和感官評分呈先增大后減小的趨勢。可能是當菌種添加量過低時，不能充分利用米湯中的氮源和碳源轉化為有機酸，使總酸和感官評分降低，但當菌種添加量過高時，在生長環境容量一定的條件下，菌種大量繁殖，形成種內競爭關系，導致發酵后期菌種大量死亡，菌體自溶產生苦澀味，感官評分降低，總酸也無明顯增加。因此最佳菌種接種量為5%。

a-時間；b-溫度；c-pH；d-接種量

2.2 響應面與驗證試驗

2.2.1 響應面試驗

2.2.2 驗證試驗

以總酸為主要評測指標，通過二次回歸模型的預測米酸湯發酵的最佳工藝條件，發酵時間104 h、接種量為5.11%、發酵溫度36.32 ℃、pH值6.59。此時米酸湯的酸度為9.43 g/L。根據響應面最佳條件進行3次平行實驗得到米酸湯酸度(9.48±0.08) g/L，接近理論預測值，相對誤差為0.73%，說明響應面分析法適用于米酸湯發酵工藝的優化研究。

2.3 米酸湯在貯藏期間理化參數變化

2.3.1 貯藏期間理化指標隨時間的變化

由圖2-a可知，在同一溫度下，樣品的離心沉淀率隨時間延長而增加，在同一時間下，離心沉淀率隨溫度的升高而變大，米酸湯的穩定性也就越差。說明貯藏時間越長，大分子之間發生聚集的次數越多，沉淀積累越多，溫度的升高也加快了大分子物質之間的碰撞頻率，使得分子之間更容易聚集，降低了米酸湯的穩定性。

表2 響應面設計方案及響應值結果

表3 總酸回歸模型方差的分析結果

由圖2-b可知，在同一溫度下，粒徑隨貯藏時間延長而增大，說明米酸湯貯藏過程中懸浮顆粒不斷聚集。同一時間下，溫度越大粒徑的聚集速度越快，從而改變原有顆粒的粒徑大小，使得粒徑值變大。

由圖2-c可知，在同一溫度下，樣品的黏度隨時間延長而減少，在同一時間下，溫度越高樣品的黏度越小，說明米酸湯在貯藏期間一些直鏈或支鏈淀粉等大分子物質繼續水解，降低了直鏈或支鏈淀粉在膠體中的比例，使黏度下降。

由圖2-d可知，在在同一時間下，米酸湯的色差值隨溫度上升而增加。表明米酸湯貯藏過程中蛋白質或氨基酸與葡萄糖之間發生Mailard反應[23]，導致米酸湯顏色變深，溫度越高，Mailard反應越快，色差值越大。

由圖2-e可知，在貯藏(0～30) d時，pH值隨時間和溫度的變化基本不變；在貯藏30 d后，同一溫度下樣品的pH值隨時間延長而增大。在同一時間下，溫度越高，樣品的pH值越大，表明米酸湯在貯藏期間，體系中堿性化合物增加或產生堿性細菌，導致pH值增大。

由圖2-f可知，在不同貯藏溫度的條件下，米酸湯的感官評分隨貯藏溫度的增加而減少；在同一溫度下貯藏時，貯藏時間越長，感官評分越低。表明米酸湯貯藏過程中的顆粒聚集，黏度下降，米酸湯的內部形態下降，感官評分降低。在貯藏時間相同時，感官評分值隨貯藏溫度增大而降低。表明溫度升高，Mailard反應加快，米酸湯色澤變深，沒有光澤，口感降低。

2.3.2 米酸湯理化指標和感官指標的相關性

在貯藏期間，米酸湯的理化指標與感官評分的Pearson相關性如表4所示。由表4可知，在貯藏溫度為25、 34、 45 ℃時，離心沉淀率和色差值的Pearson最大，均>0.99，(P<0.01)與感官評分極顯著負相關，分別是0.990、0.995、0.998、0.995、0.998、0.997；可能是米酸湯貯藏過程中的懸浮顆粒發生聚集現象，導致離心沉淀率變大，也可能是米酸湯儲存過程中發生Mailard反應，導致樣品顏色變深。由表5可知，離心沉淀率和色差值與感官評分的回歸方程在不同溫度下R2均>0.9，表明其與感官評分的相關性關系很好。綜上所述，可以把離心沉淀率和色差值作為米酸湯品質變化和貯存穩定性動力學和熱力學預測模型的主要因素。

a-離心沉淀率；b-粒徑；c-黏度；d-色差值；e-pH值；f-感官評分

表4 米酸湯在25、35、45℃貯藏期間理化指標和感官評分之間的 Pearson相關系數

注：*,顯著相關(P<0.05)；**,極顯著相關(P<0.01)

2.3.3 貯藏期間米酸湯理化參數變化的熱力學和動力學分析

按照公式(1)分別計算米酸湯貯藏期間離心沉淀率、色差值零級和一級的反應級數，如表6所示，在25、35、45 ℃下零級、一級回歸方程的R2均>0.9，表明擬合程度很好。但是離心沉淀率和色差值的ΣR2均較零級的大，因此符合一級反應化學動力學。根據公式(2)求出反應活化能，再根據公式(3)～公式(5)可計算反應的熱力學參數，如表7所示，Ea越小，表示反應越容易進行，離心沉淀率和色差值的Ea都比較小，離心沉淀率的活化能低，體系中絡合物容易產生，導致沉淀發生，離心沉淀率也隨溫度的升高而增大；溫度越高越能促進絡合物的形成，體系的穩定性越差[24]。色差值的活化能低，米酸湯中的蛋白質或氨基酸與葡萄糖之間發生羰氨縮合的Mailard反應越容易，導致顏色加深，溫度高也能促進Mailard反應，體系的顏色變化越大。Gibbs自由能表示反應物的能量和活化狀態之間的變化，在化學熱力學中為判斷過程進行的方向，離心沉淀率Gibbs自由能為(83.17～87.89) kJ/mol，色差值Gibbs自由能為(82.65～85.90) kJ/mol，故反應都為非自發反應[25]。Gibbs自由能隨溫度增加而遞增，建立Gibbs自由能與溫度回歸方程以表明化學反應與宏觀物理變化之間的相關性。離心沉淀率的Gibbs自由能與溫度之間回歸方程的相關系數為0.999 1，色差值Gibbs自由能與溫度之間回歸方程的相關系數為0.999 7，如表8所示。

表5 不同溫度下色差值和離心沉淀率的回歸方程

注：SS,感官評分；CSR,離心沉淀率；d,粒徑；E,色差值

2.4 米酸湯穩定性動力學模型

2.4.1 預測米酸湯穩定性的動力學和熱力學模型

表6 米酸湯在不同貯藏溫度下品質變化的動力學模型參數

表7 米酸湯動力學與熱力學參數

表8 米酸湯理化參數吉布斯自由能與溫度的回歸方程

注：回歸方程表示為ΔG*(kJ/mol)=f(T)

2.4.2 米酸湯穩定性預測模型的精確度評價

根據實驗的實測值和模型預測值，計算出米酸湯穩定性預測標準差、模型誤差。由表9可知，離心沉淀率與色差值預測模型誤差平均值分別為13.46%、6.07%，均<15%，表明預測模型的精確度良好，可以滿足預測米酸湯的穩定性要求。

表9 米酸湯的穩定性預測模型的殘差變異系數

2.5 米酸湯風味測定

圖3表示米酸湯在不同貯藏溫度下180 d的電子鼻區分度(discrimination index，DI)達99.3%，電子舌區分度達99.98%,一般情況下認為DI值>80%區分效果較好，DI值越大表示樣品間的距離越遠，區分的效果越理想。由此可見，米酸湯在不同貯藏溫度下180 d的揮發性氣味和風味成分有明顯區別。

a-主成分得分；b-判別函數分析

3 結論

響應面優化后工藝條件參數為發酵時間104 h、接種量為5%、發酵溫度36℃、pH值6.6，得到的酸度為(9.48±0.08) g/L，與模型預測值酸度9.43 g/L分基本一致，通過響應面優化米酸湯發酵有一定的現實指導意義。

通過米酸湯理化指標在不同貯藏溫度下隨時間的變化關系，建立米酸湯離心沉淀率和色差值與感官評分、貯藏溫度、貯藏時間之間的動力學和熱力學數學模型，建立該產品的預測模型。計算出離心沉淀率和色差值預測模型誤差CV平均值分別為13.46%、6.07%,均<15%。因此，根據米酸湯在貯藏期間的離心沉淀率與色差值2個指標所建立的預測模型可以較好地預測 25～45 ℃條件下米酸湯的貯存穩定性，為預測其貯藏穩定性提供參考。

電子鼻和電子舌主成分分析DI值均>99%，可以說明米酸湯在不同貯藏溫度下180 d的揮發性氣味成分和風味成分有明顯區別。