淡竹、毛竹竹瀝化學成分鑒定及制備方法比較

朱睿，陳波，張清峰*

1(江西農業大學 食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌，330045)2(江西維萊營健高科有限公司，江西 吉安，331500)

竹子為禾本科竹亞科植物[1]，其種類繁多，生長周期短，資源豐富。中國在竹資源種類、分布、產量、季節適應性均世界領先[2]。竹子在食品領域也被廣泛使用，如中國自古就有食用竹筍的習慣，竹葉黃酮是國家衛計委批準的新食品原料[3]。傳統竹瀝是將竹竿用火烤灼后流出的淡黃色液體，我國有悠久的飲用歷史，也是許多保健食品及夏季解暑飲料的原料。

中醫記載竹瀝有清熱化痰，開竅定驚等功效，可用于治療呼吸系統疾病。王芳等[4]研究發現竹瀝能有效促進NO的分泌，減少煙熏所致慢性支氣管炎模型大鼠肺組織炎癥的介質分泌，減輕炎癥損傷。羅懷浩等[5]發現竹瀝不同程度的提高了小鼠氣管酚紅分泌，延遲了咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數。巨亞敏等[6]應用市面上竹瀝膠囊治療急性咽喉炎，可更快緩解及明顯消除相關臨床癥狀。余亞平等[7]發現復方鮮竹瀝液與布地奈德和孟魯司特鈉聯合治療咳嗽性哮喘可降低血清IgE、TNF-α 和IL-8水平，改善一些肺功能指標，減少復發率，安全性良好。目前研究認為竹瀝中主要活性成分有愈創木酚、苯酚、紫丁香醇、去甲綿馬酚和5-叔丁基焦酚等[1, 8-10]。姚金龍等[9]還從鮮竹瀝乙酸乙酯萃取部分鑒定了丁香醛、松柏醛、香草酸、4-甲氧基肉桂酸等化合物。張規富等[11]鑒定了雷竹瀝中甲肼、乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛等成分。

傳統竹瀝通常以禾本科剛竹屬淡竹為原料制得。但禾本科剛竹屬毛竹較淡竹分布更廣，資源更豐富。但以毛竹為原料制備的竹瀝在化學成分上是否與淡竹竹瀝有顯著差異？此外，現代竹瀝工業生產通常將火烤灼改為干餾，但仍存在得率低、竹資源利用低下的特點。如能采用水煮方法將極大提高得率并簡化工藝，但這是否會導致竹瀝成分差異？針對這些問題，本研究以毛竹和淡竹為原料，分別經干餾和水煮獲得竹瀝，通過UPLC-DAD-QTOF-MS進行了成分分析；并對總酚、總黃酮、總氨基酸、對香豆酸等定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮毛竹、淡竹竹竿產自江西省永豐縣，由江西維萊營健高科有限公司提供。對香豆酸(≥98%)、蘆丁(≥98%)、L-谷氨酸(≥99%)、福林酚等購自北京索萊寶科技公司；Na2CO3、CH3COOK、Al(NO3)3、K2HPO4、KH2PO4、茚三酮、沒食子酸等購自天津市大茂化學試劑廠，所用試劑均為分析純。仁和?復方鮮竹瀝液，江西遠東藥業股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HPLC為Agilent 1260系統，配自動進樣器和DAD檢測器,美國安捷倫科技有限公司；V-5600可見分光光度計,上海元析儀器有限公司；UPLC-DAD-QTOF-MS，質譜部分為Q-TOF 5600+ (AB Sciex Corporation, Foster City, CA, USA)，UPLC部分為島津LC-30A-DAD系統(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 干餾法制備竹瀝

將竹竿切成長寬約1～2 cm的碎塊，將500 mL圓底燒瓶裝滿后置于電熱套中。將整體倒置并固定，200oC烤制1 h，在瓶口流出的即為干餾竹瀝。

1.3.2 水提法制備竹瀝

將竹竿切成長寬約1～2 cm的碎塊后，用粉碎機粉碎。按料液比1∶10加入蒸餾水，沸水浴中加熱1 h，過濾后得水提竹瀝。

1.3.3 竹瀝HPLC分析條件

流動相為乙腈(A)及0.1%醋酸水溶液(B)，線性梯度程序為0～15 min，10%～20% A；15～40 min，20%～40%A。流速1 mL/min，柱溫為40 ℃ ，進樣量10 μL。對香豆酸在310 nm下的定量標準曲線為Y=62.195X(R2=0.999)，X為對香豆酸質量濃度(μg/mL)，Y為峰面積。

1.3.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

UPLC使用色譜柱為Acquity BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, Waters)。流速為0.3 mL/min，進樣量為2 μL，柱溫為40oC。流動相為乙腈(A)及0.1%甲酸水溶液(B)，線性梯度程序為0～15 min，10%～15%A；15～20 min，15%～30% A。質譜系統為負離子模式，離子噴霧電壓為-4 500 V，溫度為500 ℃。數據分析軟件為Analyst 1.6。

1.3.5 竹瀝中總黃酮測定

參考國家標準[12]。配制蘆丁標準液(200 μg/mL)，吸取不同體積于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至總體積為7.5 mL。依次加入100 g/L硝酸鋁溶液0.5 mL，9.8 g/L醋酸鉀溶液0.5 mL，定容搖勻，靜置1 h。以30%乙醇溶液為空白，在415 nm下測定吸光度。繪制標準曲線為Y=1.23X(R2=0.999)，X為反應體系中蘆丁質量(mg)，Y為吸光度。

1.3.6 竹瀝中總多酚測定

參考何新益，劉清等[13-14]方法,配制沒食子酸標準溶液(158 μg/mL)4 ℃保存，準確吸取不同體積于10 mL容量瓶中，依次加入福林試劑0.5 mL，15%的Na2CO3溶液1 mL，充分混合后定容，30oC避光放置1 h，以蒸餾水為空白，在760 nm波長測定吸光度。繪制標準曲線得Y=9.03X(R2=0.996)，X為沒食子酸在反應體系中質量(mg)，Y為吸光度。

1.3.7 竹瀝中總游離氨基酸測定

參考國家標準[15]。配制L-谷氨酸溶液(205 μg/mL)，準確吸取不同體積于25 mL容量瓶，加入2%茚三酮1 mL，磷酸緩沖液(pH 8.0)1 mL，100oC水浴15 min后定容，靜置15 mL，570 nm測定吸光度。繪制標準曲線Y=2.72X-0.395 6(R2=0.998)。X為谷氨酸在反應體系中質量(mg)，Y為吸光度。

1.4 數據統計

實驗平行重復3次，取其平均值，結果均用Microsoft Excel 2010進行數據計算、分析。曲線圖以Origin 9.0進行繪制。

2 結果與分析

2.1 UPLC-DAD-QTOF-MS鑒定竹瀝中化學成分

圖1為不同方法制備的毛竹和淡竹竹瀝經UPLC分離后，由DAD檢測器在280 nm波長下記錄的色譜圖。毛竹和淡竹竹瀝主要化學成分很相似，都含有1～4 號峰，但含量差異很大。峰2、3為淡竹竹瀝主要成分，峰1、3和4為毛竹竹瀝主要成分。峰3是兩者的共同的主要成分，但淡竹中峰面積要大于毛竹。峰2在淡竹中含量較高，而在毛竹中很低；而峰4在毛竹中含量較高，在淡竹中很低。水提和干餾法獲得的各竹瀝在成分上無顯著差異，但水提液中主要峰(峰2和3)的峰面積更大。圖2為通過DAD檢測器獲得的4個主要峰的UV圖譜。峰1、2和4的最大吸收峰均在280 nm左右；而峰3的最大吸收峰為310 nm左右。

A-淡竹(a)、毛竹(b)水提液;B-淡竹(a)、毛竹(b)干餾液

圖2 淡竹和毛竹瀝色譜圖中4個主要色譜峰UV光譜圖

通過QTOF-MS聯用，我們可以進一步獲得各色譜峰的分子質量和碎片離子情況，從而對其進行結構鑒定。表1為4個主要色譜峰的質譜信息及鑒定結果。除峰2外，其余3個峰都得到鑒定，它們的二級質譜圖和可能化學結構見圖3。峰3的分子離子([M-H]-)為m/z163，主要碎片為m/z119、117和93，經與文獻比對鑒定為對香豆酸[16]。進一步比較了峰3和對香豆酸對照品的HPLC保留時間和UV光譜，發現兩者完全一致。研究表明，對香豆酸具有較強的殺菌作用，可以破壞細菌細胞膜，結合細菌DNA；此外，還有抗氧化作用，能清除DPPH、ABTS等自由基及還原Fe3+[17-18]。峰4的分子離子([M-H]-)為m/z581，其碎片離子m/z419來源于[M-H]--162，說明其分子中含有已糖；此外，多個碎片間相差m/z15，說明其分子結構中含有多個甲基。經與文獻比對，峰4鑒定為lyoniresinol-glucopyranoside，是一種木質素糖苷[19]。因為含量較低，竹瀝中一些成分的色譜峰在DAD檢測器中可能會被掩蓋。通QTOF-MS，可以對特定的離子進行提取。圖5為淡竹和毛竹竹瀝中綠原酸類化合物的離子提取色譜圖。m/z337.1，353.1，367.1，515.1分別為對香豆酰奎寧酸、咖啡酰奎寧酸、阿魏酰奎寧酸和二咖啡酰奎寧酸的分子離子([M-H]-)。以這些質荷比為離子提取條件，并通過提取色譜峰的二級質譜碎片進行進一步確認結構。奎寧酸有3-OH、4-OH和5-OH可與對香豆酸、咖啡酸等形成酰基，因此會有多個異構體。一些研究通過碎片峰形成及豐度情況來判定成酰位置。當酰基位于3-或5-時，[quinic acid-H]-(m/z191)碎片豐度最強；且當位于3-時，[coumaroyl acid-H]-(m/z163)、[caffeic acid-H]-(m/z179)或[feruloyl acid-H]-(m/z193)的碎片豐度相對于5-更強。當酰基位于4-時，[quinic acid-H2O-H]-(m/z173)豐度最強[20]。一些其他二級質譜碎片來源，m/z134為 [feruloyl acid-CO2-CH3-H]-，m/z119為[coumaroyl acid-CO2-H]-，m/z135為[caffeic acid-CO2-H]￣。

根據圖5幾種綠原酸類化合物的離子提取色譜圖來看，毛竹瀝中綠原酸類含量及種類比淡竹瀝要豐富得多。在毛竹瀝中發現有9種綠原酸類物質，并且以咖啡酰奎寧酸含量較多；而淡竹瀝中幾乎沒有咖啡酰奎寧酸，阿魏酰奎寧酸和對香豆酰奎寧酸含量也顯著低于毛竹。綠原酸類化合物作為植物中常見的次生代謝產物，具有多種顯著的生物活性，如抗氧化、抑菌、降血壓等[21-22]。

此外，通過QTOF-MS，我們還發現竹瀝中有蘋果酸、檸檬酸等有機酸，并鑒定了一些其他痕量成分，包括一些酚酸糖苷(如水楊酸、原兒茶酸等)和黃酮苷(主要為芹菜素)，詳細結果見表3。另外，值得一提的是，許多研究認為愈創木酚是竹瀝的主要功效成分[1, 10]。但我們以愈創木酚的準分子質量([M-H]-，m/z123.1)為離子提取條件，提取色譜圖中并沒有明顯的色譜峰。說明愈創木酚在竹瀝中含量甚微，可能并不是竹瀝主要功效成分。

UPLC-DAD-QTOF-MS分析結果表明，毛竹和淡竹竹瀝成分非常相似；對香豆酸是2種竹瀝主要的酚酸成分，但含量差異較大。比較了水提和干餾法制備的竹瀝成分差異，表1和表3中的結果表明所有在干餾竹瀝中發現的化學成分在水提竹瀝中都可以檢出，說明2種制備方法不影響竹瀝主要成分。

表1 淡竹和毛竹瀝色譜圖中4個主要色譜峰的質譜信息及鑒定結果

注：R1-淡竹水提液；R2-毛竹水提液；R3-淡竹干餾液；R4-毛竹干餾液。+表示有該成分(下同)

表2 淡竹和毛竹竹瀝中綠原酸類化合物的質譜信息

2.2 毛竹和淡竹竹瀝中主要成分定量

根據QTOF-MS分析結果，對香豆酸是毛竹和淡竹竹瀝中主要酚酸成分。此化合物具有多種顯著生物活性，因此我們通過HPLC對其進行了定量測定。同時，還測定了干餾和水提法獲得的2種竹瀝中總黃酮、總多酚和總游離氨基酸，詳細比較結果見表4。相對于原料重量，干餾法竹瀝的得率不足10%；而水提法得率與料液比有關，本實驗中料液比為1∶10，因此得率為1 000 %。定量分析結果表明，水提淡竹竹瀝中對香豆酸、總黃酮、總多酚和總游離氨基酸含量分別為28.2、8.2、162.6、92.7 μg/mL，這些值都高于干餾法獲得的淡竹竹瀝。比較不同方法獲得的毛竹竹瀝，除多酚外，其他成分也是水提竹瀝樣品中含量最高。此外，毛竹竹瀝的總多酚和總黃酮含量遠高于淡竹竹瀝。

A-峰1;B-峰3;C-峰4

A-毛竹水提竹瀝:B-淡竹水提竹瀝

2.3 市售復方鮮竹瀝HPLC分析

復方鮮竹瀝是較受歡迎的中成藥，它以竹瀝為主要成分，常用于治療小兒咳嗽。圖5是對香豆酸標準品，毛竹、淡竹水提液和市售仁和?復方鮮竹瀝液的HPLC分析色譜圖。對香豆酸標準品的出峰時間為16.3 min。在相同保留時間下毛竹、淡竹水提液和復方鮮竹瀝液均有對應的色譜峰，其UV光譜圖也和對香豆酸標準品一致。說明市售復方鮮竹瀝中確實含有來自于竹瀝的對香豆酸。另外，復方鮮竹瀝原料中還有魚腥草、生半夏等，因此其色譜圖中還有很多其他成分峰。對香豆酸具有較強的殺菌和抗氧化作用，因此可能是竹瀝功效的重要物質基礎；其含量也遠高于常用于評價竹瀝質量的愈創木酚。因此，我們認為對香豆酸是竹瀝一個重要的質量指標。

表4 毛竹和淡竹竹瀝定量分析結果

表3 淡竹和毛竹竹瀝中鑒定的其他成分質譜信息

圖5 對香豆酸標準品(a)，毛竹水提液(b)，淡竹水提液(c)和市售仁和?復方鮮竹瀝液(d)的HPLC分析色譜圖(280 nm)

3 結論

UPLC-DAD-QTOF-MS分析結果表明，毛竹和淡竹竹瀝成分差異不大。對香豆酸是兩者主要的酚酸成分，但淡竹中含量高于毛竹；毛竹瀝中木質素糖苷Lyoniresinol-glucopyranoside含量高于淡竹。從痕量成分看，毛竹瀝中綠原酸類含量及種類較淡竹瀝豐富；此外，兩者還含有蘋果酸、檸檬酸、及酚酸糖苷和黃酮苷等15個共有成分。水提法制備竹瀝操作簡單，且得率遠高于干餾法；并且產品中對香豆酸、總黃酮、總多酚和總游離氨基酸含量也更高。對香豆酸和綠原酸類物質是抑菌、抗炎活性研究較多的植物次生代謝產物，與竹瀝傳統功效相吻合。在市售復方竹瀝中同樣發現了對香豆酸成分。基于實驗結果，我們認為毛竹可以用于生產竹瀝，并且用對香豆酸比愈創木酚更適合作為竹瀝質量評價指標。