基于GC-IMS技術分析糙米儲藏過程中風味物質變化

王熠瑤,張烝彥,孫俊,常亞飛,呂飛,丁玉庭,周緒霞*

1(浙江工業大學 食品工程與質量控制研究所，浙江 杭州，310014)2(杭州市糧油中心檢驗監測站，浙江 杭州，310014)3(杭州市糧食收儲有限公司，浙江 杭州，310014)

糙米因內保護皮層粗纖維保留較完整，富含多種維生素、礦物質、抗氧化成分等營養物質和谷維素、生育酚、阿魏酸和生育三烯酚等植物化學成分，越來越多成為健康人士追求并長期選擇的綠色食品[1-5]。但由于失去稻殼的保護，糙米在儲藏過程中易隨著儲藏期的延長而發生品質變化，逐漸失去了原有的特征香味，產生各種腐敗、霉異味等不良氣味。通過對糙米中酮類、醛類、酯類、醇類、烴類、有機酸類以及雜環類化合物等揮發性成分的測定，可以鑒定和分析出不同儲藏狀態和不同新鮮度糙米的揮發性成分及其含量的變化差異[6]。因此，揮發性風味物質是評價儲藏過程中糙米品質變化的一項重要指標[7-8]。

目前分析糙米揮發性風味成分的技術有電子鼻技術、氣相色譜-質譜聯用、頂空固相微萃取-氣質聯用技術等[9]。電子鼻技術具有客觀、操作簡單、重現性能良好等優勢，但存在精度低、傳感器易漂移等缺點。氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)作為一種新的聯用技術，樣品分子通過GC預分離后，經過氚源軟電離產生分子離子，在漂移管進行常壓二次分離[10-12]。相比于氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)，其分離能力更強，大大降低了儀器成本，同時也避免了耗時久、操作復雜、碎片離子解譜困難等缺點。通過將氣相分析技術和離子遷移譜巧妙有機結合，GC-IMS可快速、簡捷、直觀地對檢測結果進行高精度分析，且不需要樣品前處理和加熱過程，可最大程度保留樣品原有的風味信息，使分析結果更具真實性和說服力[13-16]。GC-IMS技術已越來越多的應用于農殘檢測、食用油品質鑒定、蜂蜜摻假鑒別、水產品新鮮度評估等食品領域，但涉及與糧食作物有關的研究頗為少見[17-22]。韓國農業推廣中心采用GC-IMS技術研究發現2-乙?；?1-吡咯啉是香米中香味物質的主要來源，通過對比其含量高低可判別香米等級[23]，但目前尚未應用于糧食新鮮度的評價中。

本文首次采用GC-IMS技術對不同儲藏環境和不同儲藏時間糙米中揮發性有機物質的差異信息進行分析，以期為快速判別糙米儲藏過程中品質變化特別是新鮮度變化提供一種新的思路和檢測方法，同時為基于GC-IMS技術的糙米風味信息指紋圖譜數據庫提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

一級粳型糙米(含水量14.3%)，由浙江恒天糧食股份有限公司提供(2016年12月收獲于浙江杭州)。

1.2 儀器與設備

FlavourSpec 1H1-00053型頂空氣相-離子遷移譜儀，德國G.A.S.公司；配備CTC CombiPAL頂空自動進樣器，瑞士 CTC Analytics AG公司；CLOT 毛細管柱(15 m×0.25 mm×0.50 μm，德國CS-Chromatographie Service GmbH；氚電離源。

1.3 實驗方法

1.3.1 儲藏模式設計

粳型糙米以編織袋形式進行包裝，每袋25 kg，袋裝糙米按照層疊方式擺放，以聚氯乙烯薄膜槽管五面封密封方式儲藏于杭州市糧食收儲公司南星橋分公司的14 ℃恒溫地下倉中。糙米樣品按照包裝方式不同分成A、B兩組，A組通過充N2進行氣調包裝(N2濃度≥98 %)；B組為普通氣體包裝。儲藏期為18個月，期間每隔0、6、12和18個月分別取樣，分析儲藏期內糙米風味物質變化過程。

樣品編號依次為：A-0、B-0、A-6、B-6、A-12、B-12、A-18和B-18，每組樣品取3個重復。

1.3.2 GC-IMS分析方法

頂空進樣條件：稱取3 g糙米，置于20 mL頂空樣品瓶中，密閉封口后進行檢測。頂空孵育溫度60 ℃；采用振蕩加熱；孵育轉速500 r/min；孵育時間15 min；頂空進樣針溫度85 ℃；進樣量500 μL；清洗時間30 s。

GC 條件：色譜柱 FS-SE-54-CB-1(非極性，15 m × 0.53 mm × 0.5 μm)； 色譜柱溫度 60 ℃; 運行時間 20 min; 載氣(高純N2，純度≥99. 999%)；流速: 初始2.0 mL/min，保持2 min后在10 min 內線性增至15 mL/min，之后在20 min內線性增至100 mL/min。

IMS 條件：漂移管長度 5 cm；管內線性電壓 400 V/cm；漂移管溫度 45 ℃；漂移氣為高純N2(純度≥99.999%)；流速 150 mL/min；IMS探測器溫度 45 ℃。

1.4 數據分析與處理

采用GC×IMS Library Search V 2.2.1分析軟件，利用內置NIST數據庫和IMS數據庫對樣品中揮發性風味物質進行定性分析。結合Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件采用LAV(laboratory analytical viewer)對其建立標準曲線后進行定量分析，分別對數據進行多角度分析處理，獲得二維、三維譜圖，根據指紋圖譜對比，直觀且定量地比較儲藏過程中糙米樣品之間的揮發性有機物差異。采用MATLAB.R2017b對數據進行PCA分析和K均值聚類分析(K-means cluster)。

2 結果與分析

2.1 儲藏期內糙米的GC-IMS譜圖分析

圖1為根據LAV分析得到的儲藏過程中2種包裝條件糙米的GC-IMS三維譜圖。可以直觀看出，8組糙米樣品在儲藏過程中揮發性有機物(volatile organic compounds，VOCs)的種類較為相似，組間差異性觀察存在困難。為了更好地橫向比較分析儲藏時間和儲藏條件對糙米風味物質的影響，通過采用差異對比模式，將譜圖降維處理。圖2為圖1的二維俯視圖，為了更加鮮明比較樣品間的差異性，取樣品A-0作為參比，其余7組樣品依次扣減參比，扣減后背景色褪至白色。若糙米樣品中VOCs含量高于參比，該物質顯示紅色；若糙米樣品中VOCs含量低于參比，該物質顯示藍色。橫坐標1.0處紅色豎線為經歸一化處理后的反應離子峰(reactive ion peak, RIP)。RIP 峰兩側的每一個點代表著一種揮發性有機物，點的顏色深淺直觀反映出揮發性有機物濃度的高低變化，顏色越紅，說明該種VOCs伴隨儲藏期含量上升，顏色越藍，說明該VOCs在儲藏過程中逐漸流失。

圖1 不同儲藏條件糙米的GC-IMS三維譜圖比較

由圖1可知，VOCs在離子遷移過程中，保留時間與漂移時間的二次方呈正比，即VOCs在遷移譜中保留時間越長，其對應的漂移時間相對越長。保留500～550 s時進行漂移的有機物，在A-6和B-6、A-12和B-12中顏色變化顯著，說明保留至最后漂移出來的有機物受N2包裝影響顯著。保留300 s以內的有機物在圖譜中逐漸由藍色轉變為黃色，說明該類有機物隨糙米儲藏時間的延長呈現下降趨勢，其中絕大多數有機物在(200±50) s時已經完成了有效遷移。

圖2 不同儲藏條件糙米的GC-IMS俯視圖差異對比

2.2 糙米揮發性有機成分定性分析

由圖2可知，糙米在儲藏過程中，VOCs的總體濃度呈下降趨勢，但對于揮發性有機物的種類并不明確，因此進一步利用內置Gallery Plot插件在VOCs圖庫中選取所有離子峰進行指紋圖譜對比。圖3為選取的59種變化明顯的部分特征離子峰的指紋對比圖譜，橫坐標是每種特征揮發性物質的編號，可以看出每組糙米樣品的完整VOCs信息以及不同儲藏時間和不同包裝下糙米樣品之間VOCs存在的差異，其中每一橫行代表一次檢測樣品所選取的全部信號峰，每一列代表同一VOCs在不同糙米樣品中的信號峰。

圖3 不同儲藏條件糙米GC-IMS譜圖中VOCs圖片庫

將指紋圖譜按儲藏期劃分成4個區域，虛線框內依次顯示的是普通包裝和N2氣調包裝下同期的2組糙米樣品，每組樣品進行3次平行實驗，每六橫行為同一儲藏期。從每組虛框內VOCs離子特征峰排列中明顯看出，普通包裝和N2包裝的差異不大，可能的原因是糙米在14 ℃低溫儲藏條件下，N2氣調對其風味物質影響不大。相同儲藏時間的糙米含有的揮發性成分，僅區別于包裝條件，樣品組內具有明顯相似性，同一包裝條件下不同儲藏時間的糙米內特有的揮發性風味物質對應時間變化而變化，樣品組間存有明顯差異。根據對特征VOCs離子峰的保留指數、遷移時間數據、各樣品中其峰體積數據和內標法計算的含量數據綜合分析得出糙米樣品相似度分析表(見表1)，組內相似度均高于95%，組間相似度則相對較低，其中普通包裝糙米儲藏18個月與對照組相比，其相似度僅有71%，說明儲藏時間越久，糙米風味變化越大，香味物質流失越嚴重，組間相似度差異性越大。

表1 不同儲藏條件糙米的相似度分析 單位：%

a-特征峰選取位置點；b-信號特征峰指紋圖譜

根據圖4-a中特征峰選取位置點分布情況，選出了反映糙米儲藏過程中具有代表性的29種VOCs信號峰進行對比，分析結果見圖4-b。根據特征峰特性，可以進一步解析出各峰所代表的風味物質，結果如表2所示。由于糙米胚中含有丙酮酸轉氨酶，如圖4虛框所示，2-乙基-1-己醇(異辛醇)和丙酮這2種物質在糙米儲存到12個月時含量大幅降低，N2包裝的含量均高于普通包裝，對比其他VOCs含量變化趨勢，普通包裝和N2包裝變化不顯著，說明N2抑制了異辛醇和丙酮的減少，N2氣調有效抑制了糙米胚中丙酮酸轉氨酶活力的激活，對糙米生命活力有一定延緩作用。X框中的物質在糙米儲存到6個月和12個月時含量下降，儲存到18個月時，含量又有所上升，其中包括1-戊醇、2-戊基呋喃、辛醛、戊醛、反-2-辛烯醛、庚醇、庚醛、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、反-2-庚烯醛和反-2-己烯-1-醇。推測造成這種變化趨勢的原因可能與糙米儲藏期間脂肪發生水解繼而又通過游離脂肪酸氧化作用生成羰基化合物有關，其中主要的羰基化合物有醛類和酮類，故糙米儲藏12～18個月時，2-丁酮、辛醛、戊醛、庚醛含量呈上升趨勢。Z框中的物質在糙米儲存到6個月時含量大幅降低，12～18個月內濃度不變或緩慢降低，隨著儲藏期延長，糙米中的香味成分逐漸流失，其中包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、1-丙醇、戊醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、乙酸丁酯和己醛等。Y框中的物質含量隨儲藏時間的延長逐漸增加，其中包括α-蒎烯、2-己酮、乙偶姻、2-甲基丙醇、2-庚酮、丁基甲酮、正丁醇、異丁醇、丙醇和乙酸丁酯等，其中乙偶姻是具有奶油香味的微生物發酵產物，結果表明，乙偶姻含量越高，受微生物污染影響越明顯，根據指紋圖譜可以快速評定儲藏期間糙米受微生物污染輕重程度。

表2 部分特征峰對應的化合物

2.3 動態主成分分析

根據圖4中不同糙米樣品VOCs的種類排布及特征離子峰強弱可大致判斷糙米的儲藏時間，為了更便于主觀觀測認知，通過LAV內置Dynamic PCA插件以原有VOCs種類的高維數組為變量進行數據降維壓縮，尋求對全部方差有影響力的2個方向，在不丟失主要信息的前提下，排除空間噪聲和冗雜信息，避開變量間共線性問題，便于對不同儲藏時間和包裝方式的糙米進行特征差異可視化動態分析[24]。由圖5可知，主成分1和主成分2的累計貢獻率達87%(已包含原有變量絕大部分信息)，通過二維平面數據點圖分布情況可直接觀測到儲藏時間和包裝方式在糙米樣品組內和組間的差異性，組內糙米樣品在一定范圍內分布較集中，相同儲藏條件下的糙米樣品重復性較好，同期2種包裝方式的樣品組間距離短，差異性不大，說明普通包裝和 N2包裝的糙米樣品之間風味很相似。數據點大致分布成3簇，6個月和12個月位置較鄰近作為一簇，均與0個月、18個月另2簇區域有明顯間距，不同儲藏時間的糙米樣品特異性較明顯，說明6個月和12個月的糙米樣品風味比較相似，與初始糙米樣品和儲存18個月的糙米樣品的風味差異較大。

2.4 K-means逐步聚類分析

將所抓取的糙米樣品全部特征峰經過PCA降維處理后的數據，通過MATLAB歐氏距離編程公式，實現計算所有樣本到聚類中心的距離并選出最小距離做類別劃分[25]。糙米樣品在進行K-means聚類分析時以儲藏時間為變量，利用距離作為度量同種包裝方式糙米個體之間關系緊密程度，檢驗其歸類效果。其聚類算法運算原理為，根據組成每一類的觀測量計算出各個變量均值，每一類中的n個均值在n維空間中形成第2次迭代類中心的y個點，繼續依次迭代，直到達到指定迭代次數，迭代終止[26]。此次參與聚類分析的糙米樣品的儲藏時間為0、6、12及18個月，故簇數量K設置為4，中心軸線交點即為每個簇設置的初始質心。圖6是為期18個月普通包裝糙米和N2包裝糙米VOCs降維數據K均值聚類分析結果，可以看出聚類效果尚佳，儲藏6個月和12個月時2簇較接近，4簇分隔較清晰，簇間分布與特征峰走勢相一致，由此可進行快速有效地根據聚類判別模型對糙米的藏儲時間進行判斷。

a-普通包裝;b-N2包裝

3 結論

本研究采用氣相色譜偶聯離子遷移譜技術，對大米儲藏過程中揮發性有機物質進行檢測，結合化學計量學和VOCs圖譜庫對糙米儲藏時間和包裝方式實現判別分析。根據揮發性物質組分特征、動態主成分分析和K均值聚類分析，初步建立了糙米行業風味GC-IMS指紋圖譜。結果表明通過GC-IMS聯用技術依據儲藏過程中VOCs含量變化可以對糙米的儲藏月份進行有效區分，不同儲藏時間的糙米樣品歸類效果較良好。糙米在14 ℃低溫儲藏環境中，與普通包裝相比，N2包裝抑制了2-乙基-1-己醇、丙酮和異辛醇在儲藏過程中的減少趨勢，對其他風味物質則影響不大。根據設置的多個檢測時間采點，獲得了多組儲藏期內糙米揮發性風味主成分信息，建立判別糙米儲藏時間的數據庫，可快速評定出糙米的儲藏期，該GC-IMS聯用技術為糙米風味研究提供了新的和理論依據和數據支持。