一種蛋白質游離氨基含量測定方法—三硝基苯磺酸法的探究

褚千千，韓秋煜，陳必文，2，包斌，2*

1 (上海海洋大學 食品學院，上海， 201306)2 (食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海， 201306)

食品是一個復雜的混合體系，蛋白質可以與其他食物成分形成復合物，導致其結構、功能和營養特性的變化。通過分析蛋白質游離氨基、巰基、二硫鍵、表面疏水性等指標的變化可以評價蛋白質與其他物質發生的反應[1-3]。其中蛋白質的游離氨基含量可采用茚三酮法[4]、三硝基苯磺酸 (trinitrobrnzen sulfonic acid,TNBS) 法[5]、鄰苯二甲醛 (O-phthaladehyde，OPA) 法[6]、高效液相色譜法[7]等方法進行分析。其中TNBS法因其靈敏度高、操作方便應用最為廣泛，本文針對TNBS法進行探討。

TNBS法是基于伯氨基與TNBS的定量反應，通過TNBS與伯胺在弱堿性條件下反應形成具有發色團的中間絡合物(圖1)，中間絡合物在355 nm和420 nm附近有最大吸收值。蛋白質中的巰基含量會影響TNBS法結果的準確性[8]，因為巰基基團會和TNBS發生反應。TNBS法應用最廣泛的是測定蛋白質水解物中游離氨基的含量[9-12]。近年來有些學者也用此方法，通過分析蛋白質游離氨基的變化研究小分子物質與蛋白質反應的機理[13-16]。以上研究中，終止反應的方法部分采用加入鹽酸，也有加入亞硫酸氫鈉，但未見文獻對這2種終止反應的方法進行比較和探討。因此本文在采用TNBS法時，在分析較優的反應條件基礎上，選擇巰基含量不同的蛋白質(牛血清蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶)，用紫外-可見分光光度計和酶標儀比較分析蛋白質游離氨基含量的準確性和靈敏性，并討論了它們的優勢和不足。同時，探討了蛋白質中的巰基含量對分析結果的影響，以期為采用TNBS法評價蛋白質游離氨基含量的變化提供參考。

圖1 TNBS與游離氨基的反應

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清蛋白(BSA),上海美倫生物科技有限公司；溶菌酶,上海生物工程股份有限公司；胰蛋白酶,國藥集團化學試劑有限公司；TNBS,Sigma；L-亮氨酸,國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaHSO3等,均為分析純。

UV1102紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司；SH-1000 Lab連續光波可調全波長酶標儀，廣州濟恒生物科技有限公司；96孔酶標板，上海康寧有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，深圳市超杰生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TNBS與游離氨基的反應

紫外-可見分光光度計測定：參照ADLER-NISSE[5]的方法，略有改動。取待測溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的緩沖溶液及1 mL 0.1% TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL HCl，至于暗處，30 min后于最大吸收波長下測吸光值。

酶標儀測定：分析步驟同分光光度計，在測定體系中樣品用量以及反應底物均縮減為紫外-可見分光光度計測定的10倍。用石英96孔酶標板進行測定。

1.2.1.2 堿性條件下終止反應

紫外-可見分光光度計測定：參照CROWELL[8]的方法，略有改動。取待測溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的緩沖溶液及1 mL 0.1% TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL NaHSO3，至于暗處，30 min后于最大吸收波長下測吸光值。

酶標儀測定：分析步驟同分光光度計，在測定體系中樣品用量以及反應底物均縮減為紫外-可見分光光度計測定的10倍。用96孔酶標板進行測定。

1.2.2 測定波長的選擇

酸性條件：準確配制0.5 mmol/L的L-亮氨酸，分析步驟同1.2.1.1。以超純水作對照進行基線掃描，在200～400 nm波長掃描，確定反應產物的最大吸收波長。

堿性條件：準確配制0.5 mmol/L的L-亮氨酸，分析步驟同1.2.1.2。以超純水作對照進行基線掃描，在400～600 nm波長掃描，確定反應產物的最大吸收波長。

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1.2.3 標準曲線的繪制

以L-亮氨酸為游離氨基底物，做標準曲線，方法同1.2.1。比較不同條件下得到的標準曲線，選擇TNBS與游離氨基反應的最優條件。

1.2.4 三種蛋白質游離氨基含量的分析

準確配制不同濃度的牛血清蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶的水溶液，在最優條件下測定游離氨基含量，測定方法同1.2.1。

1.2.5 統計與分析

本文實驗所有樣品均為3組平行。作圖采用Origin Pro 9.1軟件，采用SPSS statistic 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖2可知，TNBS與0.5 mmol/LL-亮氨酸在酸性條件終止反應得到的反應產物在340 nm處有最大吸收波長，結果與SATAKE等[17]得到的一致；在堿性條件終止反應得到的反應產物的最大吸收波長為420 nm，(圖3)，結果與FIELDS[18]的描述一致。

圖2 TNBS與L-亮氨酸在酸性條件下反應產物的波長掃描

圖3 TNBS與L-亮氨酸在堿性條件下反應產物的波長掃描

2.2 不同反應條件下標準曲線的比較

圖4、圖5為酸性與堿性反應條件下分別采用紫外-可見分光光度計和酶標儀所獲得的L-亮氨酸標準曲線。不論是采用紫外-可見分光光度計還是酶標儀進行測定，同一濃度L-亮氨酸在堿性條件下得到的吸光度值都高于酸性條件。采用紫外-可見分光光度計測定時，各濃度L-亮氨酸在堿性條件下所得到的吸光度值比酸性條件的高0.03～0.04；采用酶標儀時，堿性比酸性條件下吸光度值高0.03。說明此反應在堿性條件下有更高的響應。特別是在L-亮氨酸濃度很低時(0.1 mmol/L)，2種儀器測得的酸性條件下的吸光度值很低。因而堿性條件更適合作為TNBS法的終止方式，特別是在樣品濃度較低的情況下。因此在測定蛋白質游離氨基含量時我們選擇在堿性條件下終止反應。

圖4 紫外-可見分光光度計酸性與堿性條件下標準曲線的比較

圖5 酶標儀酸性與堿性條件下標準曲線的比較

圖6為堿性反應條件下紫外-可見分光光度計和酶標儀所得標準曲線的比較。紫外-可見分光光度計所得到的標準曲線的斜率明顯高于酶標儀(P<0.01)，說明紫外-可見分光光度計測得的吸光度值對濃度的敏感程度高于酶標儀，底物濃度即使變化較小，紫外-可見分光光度計所得數據的變化較酶標儀更明顯。范鵬等[19]采用紫外分光光度計與酶標儀測定鹽酸川芎嗪含量時發現紫外標準曲線的斜率也高于酶標儀，與本文得到的結果一致。因此，在測定濃度變化較小的樣品的游離氨基含量時，可以優先考慮采用紫外-可見分光光度計進行分析。

圖6 堿性條件下紫外-可見分光光度計與酶標儀標準曲線的對比

綜上所述，通過不同條件下標準曲線的比較可知，TNBS法測定游離氨基含量時，選擇在堿性條件下終止反應，采用紫外-可見分光光度計測定是較優的方法。

2.3 紫外-可見分光光度計和酶標儀測定3種蛋白質游離氨基含量的比較

選擇在堿性反應條件下，利用紫外-可見分光光度計和酶標儀，測定不同濃度牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量，并對分析結果進行比較。

2種儀器測得的牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量都隨濃度的增加而增加(表1)。在0.02 mmol/L下，2種儀器測得的牛血清蛋白、胰蛋白酶游離氨基含量差異顯著(P<0.05)，其他濃度下差異不顯著(P>0.05)。在0.1 mmol/L下，2種儀器測得的溶菌酶游離氨基含量差異顯著(P<0.05)，其他濃度下差異性不顯著(P>0.05)。當樣品濃度較低時，由于儀器檢出限的不同，會出現差異性。肖婷等[20]等采用紫外分光光度計比色法與酶標儀微量法比較了菜青蟲Pierisrapae(L.)體內酚氧化酶蛋白含量和活力，發現微量法和比色法在檢測酚氧化酶(phenoloxidase，PO)蛋白含量、酶活力和抑制劑對PO抑制作用時結果無顯著性差異。此外，由標準差可以看出，紫外-可見分光光度法的變異程度較酶標儀較小，說明誤差較小；由標準誤可以看出，紫外-可見分光光度法的精確度較酶標儀高。因此，紫外-可見分光光度計與酶標儀都可用于游離氨基含量測定，綜合二者的優缺點并且根據實驗條件和樣品性質選擇合適的方法進行測定。

表1 兩種方法測定不同濃度蛋白質游離氨基含量的比較

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.4 蛋白質種類對TNBS法分析游離氨基含量的影響

為了探討蛋白質種類對TNBS法分析游離氨基的影響，我們比較了同一濃度下的牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量。當濃度為0.1 mmol/L時，牛血清蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶的游離氨基含量分別為(1.30±0.01) mmol/L、(0.42±0.04)mmol/L、(0.08±0.001) mmol/L(圖7)。這種差異首先是由蛋白質的一級結構決定。牛血清蛋白是包含583個氨基酸殘基，86個游離氨基的一種球蛋白；胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，含有223個氨基酸殘基，36個游離氨基；溶菌酶由129個氨基酸組成，含有15個游離氨基[21]。因而，在用此方法分析蛋白質游離氨基含量時，樣品的濃度要根據蛋白質本身含有的游離氨基數量進行調整，樣品中所含蛋白質的游離氨基數量多，取樣量可適當減少。

值得注意的是，采用TNBS法測得的每2個蛋白之間游離氨基含量的比值高于理論上每2個蛋白之間游離氨基數量的比值。牛血清蛋白的游離氨基含量約是胰蛋白酶的3倍，而理論上牛血清蛋白的游離氨基數量約是胰蛋白酶的2.4倍；胰蛋白酶的游離氨基含量約是溶菌酶的12倍，而理論上胰蛋白酶的游離氨基含量約是溶菌酶的6倍。推測蛋白質中可能存在其他能與TNBS反應的基團。ADLER-NISSEN[5]曾提出過蛋白質中的巰基基團會影響TNBS和蛋白質中游離氨基的反應。巰基存在于蛋白質半胱氨酸殘基上，牛血清蛋白含有35個半胱氨酸，17個二硫鍵；胰蛋白酶含有14個半胱氨酸，12個二硫鍵；溶菌酶是4個二硫鍵銜接起來的單鏈多肽，含有8個半胱氨酸。這些巰基很可能與TNBS反應，造成這些蛋白所測的游離氨基含量高于實際游離氨基的含量，影響到游離氨基分析的準確性。KOTAKI等[22]也證實了在氨基和巰基共同存在的情況下，TNBS優先與氨基結合。因此采用TNBS法時，如果比較不同蛋白質游離氨基的含量，需要考慮巰基含量對結果的影響。另外，巰基很容易氧化成二硫鍵，而二硫鍵由于不牢固也很容易還原成巰基。因此，二硫鍵的存在也可能會對結果造成影響。對于涉及到二硫鍵的還原的反應體系，不適合用該法測定。

圖7 不同種類蛋白質游離氨基含量的變化

3 討論

TNBS法是一種可以直接測量蛋白質游離氨基含量的簡便方法，堿性條件下的吸光度值對濃度的響應值高于酸性條件，在樣品濃度較低的情況下，建議選擇堿性終止條件。紫外可見分光光度計和酶標儀2種測定方法對蛋白質游離氨基含量的測定結果在蛋白濃度非常低的范圍內有顯著差異，濃度較高時，其結果沒有顯著性差異，但是紫外-可見分光光度計對濃度變化響應更靈敏，誤差小且精確度高。綜合紫外-可見分光光度計與酶標儀的優缺點，在實際應用時根據實驗條件和樣品性質選擇合適的方法，保證實驗的可行性與結果的準確性。同時采用方法時，需要根據樣品中蛋白質游離氨基的數量確定樣品分析濃度，且需考慮蛋白質中巰基和二硫鍵的多少和變化對該方法結果準確性的影響。