磁性四苯乙烯基高分子雙功能膠束的合成及性質

曹益華，劉 安，王李新，高建綱，林 英

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

聚集誘導發(fā)光(AIE)材料與傳統(tǒng)生色團的聚集誘導猝滅(ACQ)不同，它在稀溶液中會發(fā)出微弱的熒光信號，但在聚集狀態(tài)下熒光信號顯著增強。自從2000年唐本忠[1]發(fā)現(xiàn)了這類具有AIE特點的發(fā)光材料以來，它們已經(jīng)引起了廣泛的關注。其中，四苯乙烯基(TPE)類衍生物因其發(fā)光性能優(yōu)異、合成簡便、易官能團化、AIE效應顯著等優(yōu)點，倍受研究者的青睞。

TPE的可塑性很強，可以連接不同的親水或疏水基團、不同的小分子和高分子結構，因此近年來在化學傳感[2-4]、生物探針[5-8]等領域的應用研究上不斷取得突破性的進展。例如：Dong[9]設計合成了一種TPE衍生物，他們將ClO-與1-甲基-1，2-二氫吡啶-2-硫酮的特異反應與四苯乙烯基化合物的AIE特征相結合，設計出的熒光探針可以對ClO-具有非常強的選擇性和檢測性；Li[10]等設計了一種基于苯硼酸和苯酚的酸度差異來檢測葡萄糖的熒光探針。通過加入葡萄糖和葡萄糖氧化酶，產(chǎn)生的H2O2將苯硼酸轉化為弱酸性苯酚，降低了聚合物陰離子的負電荷，導致TPEA的分解，從而聚集誘導發(fā)光。新型的葡萄糖的熒光探針能在4～50 μM范圍內(nèi)檢測葡萄糖，最低檢測限為2.6 μM，并具有良好的選擇性，現(xiàn)已成功地應用于血糖檢測。

近年來，為了實現(xiàn)細胞內(nèi)和活體高靈敏度標記，各種策略被用來制備出大量雙功能及多功能成像的高分子復合組裝體。尤其是，唐本忠、劉斌和史向陽等課題組在該領域的深度研究引起了廣泛關注[11-13]。例如：主動靶向基團修飾的聚合物包覆熒光染料或量子點形成納米組裝體，提升了其對病變部位富集成像性能[11]。聚合物通過與超順磁性納米顆粒、金納米棒的非共價作用得到雙成像功能的納米復合物，能夠從磁共振造影(MRI)及計算機斷層掃描(CT)雙角度提供清晰的組織分析成像[13]。雖然也有利用共軛結構AIE材料與磁性納米粒子整合制備熒光-磁性納米復合物探索，但結果探針的熒光效率仍然不盡如人意，而且探針復合體的粒徑還難以控制。

基于上述分析，研究合成以四苯乙烯基(TPE)為基礎，四條臂上可控連接疏水的聚己內(nèi)酯(PCL)和親水的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的高分子材料，并通過兩親性自組裝的方式包裹Fe3O4NPs，合成了一種具有聚集發(fā)光和磁性雙功能的高分子復合材料，合成的高分子復合材料具有良好的穩(wěn)定性、磁性和聚集誘導發(fā)光性能，在生物的高靈敏度標記方面應用潛能巨大。

1 實驗部分

1.1 試劑

4，4′-二氨基二苯甲酮(分析純，阿拉丁試劑公司);ε-己內(nèi)酯(CL，使用前用氫化鈣除水干燥后，減壓蒸出)、乙烯基吡咯烷酮、Sn粉、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(分析純，上海泰坦化學品有限公司)；2-溴丙酸、乙基黃原酸鉀(分析純,TCI公司)；辛酸亞錫、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二芐醚、1,2-十二烷二醇、油酸(分析純，中國醫(yī)藥(集團)上海試劑公司)。

1.2 實驗過程

(1)4，4′，4″，4?-四氨基四苯乙烯(TPE-AM)的合成。TPE-AM是由4，4′-二氨基二苯甲酮通過Mcmurry偶聯(lián)反應得到。具體操作：依次向250 mL的三頸燒瓶中加入4，4′-二氨基二苯甲酮(0.800 g)和濃鹽酸(35 mL)，升溫至60 ℃下攪拌溶解，待溶解完全后，加入錫粉(3.000 g)，然后升溫至75 ℃，攪拌回流9 h后，冷卻至室溫。抽濾后，用1 mol/L的NaOH溶液(25 mL)洗滌，抽濾，重復兩次，然后用25 mL的去離子水洗滌，抽濾兩次，得到黃色的粉末，濾粉真空干燥，得到產(chǎn)物，即TPE-AM(0.685 g)。

(2)TPE-PCL的合成。TPE-PCL是由TPE-AM與ε-己內(nèi)酯(CL)開環(huán)聚合得到。總共按照不同分子量要求投料(如：5 K,10 K,15 K,20 K,25 K)合成了5種鏈長的TPE-PCL。以10 K分子量的合成為例，具體操作：向100 mL的磨口球瓶反應瓶中加入TPE-AM(0.0743 g)，甲苯(20 mL)，攪拌升溫至140 ℃，共沸除去大部分甲苯，殘留5 mL左右時迅速換成聚合裝置，密閉換氣閥，冷卻至室溫，再加入ε-己內(nèi)酯(1 mL)，換Ar23次，加入辛酸亞錫(9 uL)，升溫至110 ℃，攪拌下反應48 h。反應完全后，冷卻至室溫，加入10 mL的二氯甲烷溶解，后加入到冷己烷(200 mL)中沉淀，抽濾，重復兩次，固體以乙醚(150 mL)洗滌3次，真空干燥。

(3)TPE-PCL-RAFT的合成。TPE-PCL-RAFT通過TPE-PCL與乙基黃原酸酯化合成，其中，據(jù)文獻[14]報道乙基黃原酸(XA)可以由乙基黃原酸鉀和2-溴丙酸反應制得。具體操作：向100 mL的磨口球瓶反應瓶中加入TPE-PCL(0.05 mmol)和甲苯(40 mL)，共沸至2 mL左右，冷卻至室溫。將DMAP(0.6 mmol)和乙基黃原酸(2 mmol)溶于5 mL二氯甲烷，攪拌下注入體系，密封后換氣3次。將DCC(2 mmol)溶入5 mL二氯甲烷中，注入體系。室溫攪拌48 h。抽濾除去不溶物，濾液旋蒸至3～4 mL,之后緩慢滴入300 mL冷無水乙醚中，邊滴邊攪拌，靜置半天后抽濾，濾渣用4 mL二氯甲烷溶解后加入20 mL冷甲醇，攪拌5 min抽濾；再重復溶解沉淀兩次，最終產(chǎn)品真空干燥。

(4)TPE-(PCL-b-PVP)的合成。TPE-(PCL-b-PVP)是由TPE-PCL-RAFT與乙烯基吡咯烷酮(NVP)通過RAFT聚合得到。投料控制兩種鏈長聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的嵌段，分別為40 K和160 K，從而合成了10種兩類嵌段鏈長各異的星形共聚物。以TPE-PCL(10K)-b-PVP(40 K)的合成為例，具體操作：向100 mL的磨口球瓶反應瓶中加入TPE-PCL-RAFT(0.247 5 g,Mn=10 650),NVP(1 mL)，AIBN(5 mg)，瓶口用橡膠塞塞緊，Ar2換氣3次，80 ℃下攪拌8 h，冷卻至室溫。加5 mL的THF溶解，然后加入到150 mL的冷己烷中，抽濾，重復兩次，室溫真空干燥24 h。干燥完后將產(chǎn)物取出，溶于200 mL的乙酸乙酯，用來除去均聚物PCL，離心干燥，重復3次，室溫真空干燥24 h。干燥完后產(chǎn)物取出，溶于200 mL的去離子水，用來除去均聚物PVP，離心干燥，重復3次，最終產(chǎn)物室溫真空干燥24 h。

(5)四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4NPs)的制備。根據(jù)報道的溶劑熱法合成磁性Fe3O4NPs[15]：將乙酰丙酮鐵(2 mmol)加入到二芐醚(20 mL)與1,2-十二烷二醇(10 mmol)、油酸(6 mmol)的混合溶液中，并在氮氣下加入油胺(6 mmol)，加熱至200 ℃，反應2 h，然后以20 ℃/min的速度升溫至300 ℃后，老化1 h。冷卻至室溫后，得到深棕色混合物。在空氣中用乙醇沉淀離心，得到深棕色物質。將產(chǎn)物溶解在己烷中，并用乙醇再沉淀，得到Fe3O4納米顆粒。

(6)熒光納米膠束與雙功能性納米膠束的合成。高分子及其復合納米膠束在超聲輔助下，一步簡單自組裝而制得。關于熒光納米膠束合成，取10 mg星形嵌段共聚物溶解于1 mL二甲亞砜(DMSO)中，之后在超聲輔助下滴入6 mL的去離子水中，繼續(xù)以250 W功率超聲100 s，獲得泛藍光乳液。過濾除去不溶物后，在去離子水中透析24 h，得到的熒光納米膠束貯存待用。雙功能性納米膠束的合成操作如下：100 mg星形嵌段共聚物溶解于10 mL的DMSO中，0.5 mg的磁性Fe3O4NPs被均勻分散在2 mL二氯甲烷溶液中，超聲輔助下將上述兩種溶液滴入50 mL的去離子水中，繼續(xù)以250 W功率超聲100 s，獲得灰色乳液。濾去不溶物后，減壓蒸除二氯甲烷，在去離子水中透析24 h，得到雙功能性納米膠束貯存待用。

1.3 測試與表征

核磁共振波譜采用AVANCE Ⅲ HD 600 MHz型(Bruker)核磁共振儀測定，四甲基硅烷作為內(nèi)標，氘代氯仿作溶劑。凝膠滲透色譜(GPC)采用Waters 515測定，檢測器為Waters 2487紫外檢測器，Wyatt Technology Optilab rEX示差折光檢測器。流動相為四氫呋喃，流速為1.0 mL/min，檢測溫度為35 ℃。樣品的X射線粉末衍射(XRD)分析在Bruker D8衍射儀上進行，使用銅靶(Kα=0.154 18 nm)作為X射線發(fā)射源。通過透射電子顯微鏡(TEM)(HT-7700,Hitachi)觀察納米膠束的整體形貌。納米膠束的平均粒徑由Brookhaven BI9000AT動態(tài)光散射儀(DLS)測得，所有結果取3次測試平均值。納米膠束的熒光發(fā)射通過Hitachi F-4500熒光光譜儀獲得。熒光光譜儀激發(fā)和發(fā)射單色器的狹縫寬度都設定為5 nm，熒光光譜的測試樣品液均置于1 cm寬度的石英皿中。

2 結果與討論

2.1 星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成

作為內(nèi)核的四氨基四苯乙烯(TPE-AM)根據(jù)前人的報道[16]利用4,4′-二氨基二苯甲酮通過Mcmurry偶聯(lián)反應一步簡單制成。星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成過程如圖1所示。采用具有強反應活性的TPE-AM作為引發(fā)劑，以辛酸亞錫為催化劑，對ε-己內(nèi)酯(CL)進行開環(huán)聚合反應得到以四苯基乙烯為內(nèi)核的星形聚ε-己內(nèi)酯。然后，由酯化將乙基黃原酸引入聚己內(nèi)酯鏈末端作為介導試劑，AIBN引發(fā)乙烯基吡咯烷酮RAFT聚合制得基于TPE的具有雙親性的嵌段星形聚合物。至此，研究完成了具有星形結構且?guī)в袩晒夤δ艿墓簿畚锏暮铣伞?/p>

圖1 星形共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的合成路線圖

小分子發(fā)光核TPE-AM和星形聚己內(nèi)酯的化學結構以核磁共振氫譜分析如圖2所示。由圖2可以看見，氨基四苯乙烯的特征峰(δHa=6.82 ppm,δHb=6.43 ppm,δHc=3.54 ppm)，說明該化合物結構正確。此外，進一步開環(huán)聚合所得產(chǎn)品展現(xiàn)了明顯的聚己內(nèi)酯的特征峰(δHd=2.30 ppm,δHe=1.64 ppm,δHf=1.38 ppm,δHg=4.05 ppm)，證明星形聚己內(nèi)酯化合物已經(jīng)被成功合成。根據(jù)譜圖分析，聚己內(nèi)酯末端連羥基的CH2(δHg)的化學位移在4.05 ppm，而每條己內(nèi)酯直鏈上的連氧原子的氫化學位移在3.64 ppm。因每條直鏈的末端僅有一個羥基，所以可以利用聚己內(nèi)酯末端連羥基的CH2(δHg)積分值與聚己內(nèi)酯末連氧原子的氫峰的積分值計算聚己內(nèi)酯的分子量[17]。

圖2 TPE-AM和TPE-PCL的核磁共振氫譜

圖3 5種不同分子量TPE-PCL的GPC曲線

為使后續(xù)的自組裝過程能夠良好地包裹功能納米粒子，同時降低組裝體的熒光性能，控制作為引發(fā)前體的TPE-AM與單體ε-CL的投料比，合成了分子量不同的5種星形聚己內(nèi)酯(5 K，10 K，15 K，20 K，25 K)。結合氫核磁共振譜的計算結果，GPC色譜分析5種產(chǎn)物的分子量及其分布如表1所示，且兩種技術分析的結果基本一致。5種星形聚己內(nèi)酯的分子量按投料量的增加從5.6K增長至23.2K，基本接近反應設計的理論分子量。5種不同分子量TPE-PCL的GPC曲線如圖3所示。由圖3可知，所有聚合物在色譜圖上表現(xiàn)為一個單峰。

表1 5種不同鏈長的TPE-PCL分子量及分布

通過乙基黃原酸介導RAFT聚合將親水的PVP鏈段接入聚合物，控制星形聚己內(nèi)酯與NVP單體的投料量，進而合成了10種兩嵌段鏈長不同的雙親性星形聚合物。根據(jù)核磁共振氫譜分析，計算得到10種星形嵌段共聚物的分子量如表2所示。將這些共聚物分別有序地記作S1，S2，S3,…,S10，表2中顯示的分子量基本接近理論值且符合嵌段共聚物的鏈長設計趨勢。

表2 10種不同嵌段長度共聚物TPE-(PCL-b-PVP)的分子量

星形共聚物S8和S7的核磁共振氫譜如圖4所示。由圖4可知，聚己內(nèi)酯的部分特征峰(δHe=4.05 ppm)和聚乙烯基吡咯烷酮的部分特征峰(δHl+δHk=2.96～4.01 ppm)，其余基團的峰在1.3～2.54 ppm產(chǎn)生了堆積，充分證實了其嵌段共聚物的結構。在已知聚己內(nèi)酯分子量的前提下，通過PVP的兩種甲基CH2(δHl)+CH(δHk)的總積分值與聚己內(nèi)酯末端連氧的CH2(δHe)積分值的比值能計算出TPE基雙親性星形聚合物的分子量。很明顯，圖4中嵌段共聚物S8的親水PVP鏈聚合度遠大于聚合物S7上的對應鏈段。

圖4 星形共聚物S8和S7的核磁共振氫譜

2.2 熒光納米膠束和雙功能膠束的合成及表征

將星形兩親共聚物TPE-(PCL-b-PVP)溶于DMSO后，在超聲輔助下滴入去離子中得到透藍光的乳液，表明已組裝成高分子納米膠束。星形嵌段共聚物S8組裝所得納米膠束的透射電鏡圖片如圖5所示。由圖5可知，納米膠束規(guī)則的近球形的形貌、均勻的尺寸和良好的分散性，由對TEM結果中150個膠束進行測算統(tǒng)計得其粒徑約為56.7 nm。調(diào)控星形共聚物疏水鏈段和親水鏈段的長度，以獲得親疏水鏈長不同的10種化合物，達到調(diào)控最終自組裝所得納米膠束尺寸的目的。因此，源自這10個星形嵌段共聚物的納米膠束水合粒徑如圖6所示。納米膠束的水合粒徑總體表現(xiàn)為隨疏水鏈段的增長先增大后減小再增大。究其原因，在親水鏈段占優(yōu)勢時，多臂嵌段聚合物在水中以單分子膠束形式存在，增加疏水鏈段長度引起膠束聚集多分子化，持續(xù)增長疏水鏈導致膠束內(nèi)核收縮降低粒徑，之后內(nèi)核因疏水鏈繼續(xù)堆積而增大膠束體積[18]。為后續(xù)包裹磁性顆粒用作生物標記探針，選擇星形嵌段共聚物S8進一步進行膠束組裝并完成性能研究。

圖5 星形共聚物S8組裝的納米膠束TEM圖 圖6 不同星形共聚物組裝膠束的平均水合粒徑

利用溶劑熱法一步簡單制備了磁性Fe3O4NPs，其XRD圖譜如圖7所示。納米顆粒的所有衍射特征峰都很好地匹配了Fe3O4標準衍射卡片數(shù)據(jù)(JCPDS No.19-0629)。而后，超聲輔助星形嵌段共聚物S8與Fe3O4NPs自組裝，形成了灰色乳液，即制得了雙功能納米膠束。根據(jù)雙功能納米膠束粉末的XRD圖譜，25°后的衍射峰位置和形狀與純Fe3O4NPs一樣，僅因復合膠束內(nèi)磁性顆粒量較少而令衍射峰強有所減弱。因此，證明磁性顆粒確實被組裝進入了納米膠束而結構未變。所得雙功能納米膠束的TEM圖如圖8所示。無機顆粒極高的電子密度讓人很容易觀察到其在膠束內(nèi)的位置。由圖8可知，納米膠束光滑的表面及球形結構，進一步說明磁性Fe3O4NPs被有效地組裝進入納米膠束并生成了熒光磁性雙功能納米膠束。該納米膠束的水合粒徑約為365 nm，如圖9所示。聚合物鏈的干態(tài)收縮導致了DLS所得水合粒徑小于電鏡觀測的結果。

圖7 磁性Fe3O4 NPs和雙功能性納米膠束的XRD譜圖 圖8 雙功能性納米膠束的TEM圖

圖9 雙功能性納米膠束的水合粒徑分布

2.3 熒光納米膠束和雙功能膠束的性質

四苯基乙烯自身固有的聚集誘導發(fā)光性質賦予了雙功能納米膠束的熒光標記性，故而必須考察小分子核及各種星形嵌段共聚物的納米膠束的光學性質和發(fā)展趨勢。小分子TPE-AM溶于良溶劑DMSO中獲得澄清溶液，在410 nm處有一個弱的熒光發(fā)射峰。由聚合反應得到的星形嵌段共聚物在不良溶劑中組裝，所得各種膠束粒子的熒光光譜如圖10所示。由圖10可知，隨著嵌段共聚物的生長和組裝，聚集所得的發(fā)射波長紅移至488 nm(主要是由連接苯的氨基形成酰胺鍵和聚己內(nèi)酯參與的堆積態(tài)等因素引起)。星形共聚物內(nèi)疏水鏈段的增長導致苯環(huán)在納米膠束中內(nèi)旋轉受限越來越嚴重，因而其熒光發(fā)射峰強度逐漸增大。星形聚合物的納米膠束液在白光和紫外光照下的情形如圖11所示。由圖11可知，星形共聚物納米膠束由白光轉到紫外光照射下，顯示出明亮的熒光發(fā)射，昭示著星形嵌段共聚物因聚集自組裝生成納米膠束的同時伴生了極強熒光發(fā)射。

圖10 等TPE濃度下各種熒光納米膠束及小分子的熒光光譜(λex=352 nm) 圖11 星形聚合物的納米膠束液在白光(左)和紫外光(右)照下的照片

如前所述，選擇星形共聚物S8與磁性Fe3O4NPs因自組裝得到雙功能納米膠束，其熒光光譜與純S8組裝的熒光納米膠束光譜對比如圖12所示。由圖12可知，相比于空的熒光納米膠束，雙功能納米膠束的熒光發(fā)射峰因磁性顆粒裹入而稍有紅移，位于500 nm處。雙功能納米膠束的發(fā)射峰強比空熒光納米膠束降低了35%，但不影響其生物成像的使用功能。另外，雙功能納米膠束的紫外光照圖片顯示出其仍保留了較強的熒光亮度如圖13所示,進一步證明了其作為雙功能成像材料的熒光特征。擁有磁共振成像造影功能的磁性從另一個角度賦予雙功能納米膠束生物成像功能，促使該納米膠束以高靈敏度優(yōu)勢在生物標記領域表現(xiàn)出巨大的應用潛能。

圖12 星形聚合物濃度相等的熒光納米膠束與雙功能納米膠束的熒光光譜(λex=352 nm) 圖13 雙功能納米膠束在白光(左)和紫外光(右)照下的照片

3 結論

研究采用ROP和RAFT協(xié)同聚合的方式成功合成了星形嵌段共聚物TPE-(PCL-b-PVP)，通過控制反應投料比調(diào)控了嵌段共聚物的親疏水兩個鏈段長度和分子量。不同分子量星形共聚物自組裝獲得粒徑各異的納米膠束，且熒光強度隨疏水鏈段的增長而增強。為利于后續(xù)材料的生物成像應用，以形成最小粒徑膠束的星形共聚物與Fe3O4NPs自組裝成具有熒光和磁性能的高分子雙功能納米膠束，該膠束的水合粒徑為365 nm。雙功能膠束保持了TPE內(nèi)核的聚集發(fā)光性，磁性顆粒可以用于增強磁共振成像，且膠束表面的PVP鏈具有優(yōu)良的生物相容性，使所合成的雙功能納米膠束有望成為雙模態(tài)的高靈敏生物標記和成像的優(yōu)秀應用平臺。