固定化酵母細胞實驗的再探究

盧彥軍 譚慧慧

（1 岳陽市教育科學技術(shù)研究院 湖南岳陽 414000 2 臨湘市第一中學 湖南岳陽 414300）

高中生物學選修1 課題3 中“酵母細胞的固定化”實驗在2019年新增為高考內(nèi)容［1］，這對于一線學生和教師是一個新的挑戰(zhàn)。高考考試說明要求學生能獨立完成實驗，掌握相關的實驗操作技能，理解實驗目的、原理和方法，并能將實驗涉及的方法和技能等進行運用。借助這項實驗能更好地發(fā)展學生的生物學學科核心素養(yǎng)，特別有助于提升科學思維和科學探究能力［2］。

酵母菌的固定化實驗操作包括制備固定化酵母菌和用固定化酵母菌發(fā)酵2 個方面。可從2 個方面評價實驗的成敗，一是形成的凝膠珠顏色和形態(tài)；二是觀察利用固定化酵母細胞發(fā)酵的葡萄糖溶液是否有氣泡產(chǎn)生、產(chǎn)生氣泡的速度及是否有酒味。筆者在觀察學生做實驗時，發(fā)現(xiàn)對學生而言該實驗操作難度大，成功率低，明顯影響學生的實驗熱情。鑒于此，筆者對該實驗進行了再探究，從酵母細胞的活化條件、海藻酸鈉的溶化條件和海藻酸鈉的配制等實驗疑難點入手，建立多組對照實驗，反復探究，逐步優(yōu)化，提高了實驗的成功率，以下對再探究過程進行梳理，以期為學生實驗或演示實驗提供參考。

1 實驗主要疑難點及原因分析

1.1 實驗耗時長 按照本實驗的實際情況需要安排2 課時，第1 課時完成本實驗背景和基礎知識的學習，第2 課時主要進行實驗操作與評價。但往往第2 課時實驗進程很緊，影響教學進度，有些操作很耗時，例如干酵母活化時間需1 h。

1.2 配制海藻酸鈉溶液難達標 配制海藻酸鈉溶液難達標，原因是：1）海藻酸鈉為固體粉末，需加熱促進其溶解，而在加熱過程中稍不注意就會發(fā)生焦糊現(xiàn)象；2）海藻酸鈉粉末在水中不易溶解、易結(jié)塊，加熱溶解后易粘到玻璃棒和燒杯壁上，使溶液不易定容至10 mL，而結(jié)塊的海藻酸鈉固定的酵母細胞數(shù)量少，結(jié)塊部位凝膠顏色偏淺，且在制作凝膠珠時會形成不規(guī)則的尾巴。

1.3 凝膠珠容易含有氣泡 海藻酸鈉溶化后，溶液中存在許多小氣泡；用海藻酸鈉和酵母菌的混合液滴凝膠珠時，混合液中也很容易因攪拌產(chǎn)生氣泡；這些氣泡會隨著混合液進入凝膠珠內(nèi)，會使凝膠珠浮在液體表面，影響固定化細胞質(zhì)量，影響后續(xù)發(fā)酵過程。

這些主要疑難點讓學生在實際實驗操作中很難跨越，造成實驗成功率低，影響實驗教學效果。

2 疑難問題解決思路及處理方法

2.1 優(yōu)化實驗條件，減少實驗時間 設置活化時間梯度為15 min、30 min、45 min 和60 min；溫度梯度為常溫（室溫20℃左右）、30℃和40℃；經(jīng)過預實驗多次探究，獲得比較理想的方案是將高活性干酵母在35～40℃溫水中活化，活化時間為15～20 min，極大降低活化時間。該過程原方案需要教師課前準備，在優(yōu)化實驗條件縮短活化時間后，可將該環(huán)節(jié)移入課堂，學生可直觀認識酵母細胞活化中體積變化等過程。

2.2 探究海藻酸鈉溶液配制的最佳實驗方案 本實驗的最關鍵步驟在于海藻酸鈉溶液的配制，海藻酸鈉的加熱溶化、濃度控制等是實驗的難點，影響實驗成功的關鍵所在。為了獲得最佳實驗方案，筆者對該過程的2 個方面進行了反復探究［3］。

1）探究減少海藻酸鈉加熱溶化時結(jié)塊和焦糊現(xiàn)象的條件。按照表1探究海藻酸鈉溶液不同的配制方法，并進行比較。綜合實驗現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，先加海藻酸鈉易焦糊，原因是先加入的海藻酸鈉會粘連在燒杯底部，不及時攪拌或攪拌不充分，直接加熱時會使底部海藻酸鈉燒焦，學生在實際操作中極易發(fā)生此現(xiàn)象。常溫水較沸水更易結(jié)塊。方案4為最優(yōu)方案，即采取先將沸水倒入燒杯中，再加海藻酸鈉，邊攪拌邊加熱，無焦糊現(xiàn)象且結(jié)塊現(xiàn)象也明顯減少。

表1 海藻酸鈉溶液的配制方法比較

2）探究適宜的海藻酸鈉溶液濃度配制方案。海藻酸鈉溶液的配制方案的再探究實驗過程如下［4］：首先進行預實驗，海藻酸鈉采用相同質(zhì)量0.7 g,水的體積分別設置為10 mL、15 mL 和20 mL，結(jié)果確定凝膠珠成型的大概范圍為10～15 mL；盡管15～20 mL 也得到圓球形凝膠珠，但因水量增加形成的凝膠珠顏色變淺，說明凝膠珠固定的酵母細胞數(shù)量少，所以將水的選取量范圍確定為10～15 mL。然后，以1 mL 為梯度，將水的體積范圍進一步細化為9～15 mL，設置7 個實驗組，進行比較分析。實驗探究過程及結(jié)果見表2和圖1。結(jié)果表明，如果海藻酸鈉濃度過高，很難形成凝膠珠；如果海藻酸鈉濃度過低，形成的凝膠珠偏白色，凝膠珠所包埋的酵母細胞數(shù)目少，影響實驗效果（該結(jié)論是由預實驗的結(jié)果得出的）；由此得出結(jié)論，15 mL 水＋0.7 g 海藻酸鈉與10 mL 的酵母細胞溶液配制成的混合溶液制成的凝膠珠效果最佳。

表2 海藻酸鈉溶液濃度梯度與實驗效果比較

圖1 不同實驗組凝膠珠照片

在多次實驗和探究中，原方案0.7 g 海藻酸鈉加入10 mL 水配制海藻酸鈉溶液，與10 mL 的酵母細胞溶液配制成的混合溶液制作凝膠珠，其形狀很難符合要求。而0.7 g 海藻酸鈉加入15 mL水配制的海藻酸鈉溶液，再與10 mL 的酵母細胞溶液配制成的混合溶液制成的凝膠珠為規(guī)則圓球狀，成型效果最佳。

2.3 結(jié)合發(fā)酵效果再探究 經(jīng)反復探究，對比能形成規(guī)則圓球形的幾種新方案，其中最佳方案是0.7 g 海藻酸鈉加入15 mL 水配制的海藻酸鈉溶液，這與教材原方案有區(qū)別。為探究其在實際發(fā)酵中效果如何，筆者開展進一步實驗，發(fā)現(xiàn)在對照實驗中發(fā)酵效果優(yōu)勢不明顯。教材中海藻酸鈉溶液與酵母細胞溶液的體積比為1∶1，若用15 mL 加水量的海藻酸鈉與10 mL 的酵母細胞混合，會使單位體積的凝膠中固定的酵母細胞少，所以在考慮加熱過程中水分散失的情況下，將海藻酸鈉溶液的加水量定為12 mL；但由于前面實驗已確定12 mL 水加0.7 g 海藻酸鈉無法得到凝膠珠，所以減少海藻酸鈉的量進行實驗。以0.1 g 為梯度遞減，發(fā)現(xiàn)0.6 g 海藻酸鈉加12 mL 水，最終制得的凝膠珠帶小尾巴，故排除；而0.5 g 海藻酸鈉加12 mL 水配制的海藻酸鈉溶液，再與10 mL 的酵母細胞混合制得的凝膠珠是規(guī)則的圓球狀、顏色淡黃且彈性好，所以選擇0.5 g 海藻酸鈉加12 mL水配制海藻酸鈉溶液。

確定獲得凝膠珠的最佳配置方案后，對其發(fā)酵效果做再探究實驗。表3為3 種情況的實驗探究情況，發(fā)酵時間分別為20 min 和40 min。固定化酵母細胞在酒精發(fā)酵時會產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳在凝膠珠中達到一定量后，凝膠珠會浮起，故以凝膠珠在發(fā)酵中上浮情況為指標，即單位時間內(nèi)凝膠珠的浮起數(shù)量。圖2所示錐形瓶從左至右分別為表3中甲、乙、丙3 組在發(fā)酵40 min 時的效果，實驗現(xiàn)象顯示丙組的發(fā)酵效果最佳。

表3 凝膠珠的發(fā)酵效果比較

圖2 凝膠珠發(fā)酵40 min 效果

若以單位時間內(nèi)產(chǎn)生氣體的體積作為發(fā)酵效果衡量指標，理想設置應使用有刻度的水平玻璃管，通過有色液滴移動的情況精準定量。筆者在實際操作中使用同一規(guī)格的氣球作為檢測手段，進行粗略定量。圖3、圖4和圖5分別為發(fā)酵0 min、120 min 和10 h 的實驗效果，室溫約為20℃。各圖中從左至右的3 個錐形瓶分別與表3中的甲、乙、丙3 組對應。對比甲、乙、丙3 個組在相同時間段發(fā)酵產(chǎn)生氣體的體積發(fā)現(xiàn)，丙組發(fā)酵效果最好，甲組發(fā)酵效果次之，乙組發(fā)酵效果最差，說明乙組凝膠珠固定的酵母細胞最少，丙組凝膠珠固定的酵母細胞最多，即0.5 g 海藻酸鈉加12 mL 水，再與10 mL 酵母細胞溶液配置的凝膠珠形狀顏色俱佳，且發(fā)酵效果最好。

圖3 凝膠珠發(fā)酵0 min 效果

圖4 凝膠珠發(fā)酵120 min 效果

圖5 凝膠珠發(fā)酵10 h 效果

2.4 凝膠珠中易含氣泡的處理 利用真空原理排出氣體。除去混合液中的氣泡也很關鍵，將海藻酸鈉溶液和酵母細胞混合，進行充分攪拌，使其混合均勻，轉(zhuǎn)移至注射器中；將注射器活塞緩緩推進，待混合物剛溢出針孔為止，用清洗過的食指按住針孔，并將活塞緩緩后退，待混合物中空氣溢出后松開食指，推進活塞排出空氣，如此反復數(shù)次，直至無空氣再溢出為佳。這樣獲得的凝膠珠都會沉底，韌性好、有彈力。

3 小結(jié)

新的高中生物學課程標準要求教學高度關注生物學學科核心素養(yǎng)的達成［2］，積極引導和組織學生進行探究性學習，通過組織以探究為特點的主動學習落實生物學學科核心素養(yǎng)的發(fā)展。酵母細胞的固定化實驗是高中生物學選修1 中一個極富有挑戰(zhàn)性的實驗，2019年新增加為高考內(nèi)容，說明其適合學生完成。以該實驗為素材又不拘泥于教材，根據(jù)學生操作的實際情況，帶領學生一起再探究是一種體驗式學習和創(chuàng)新的嘗試，探究過程可能會出現(xiàn)一系列的新問題，卻不會有相關提示，這就需要學生和教師不斷進行預實驗，再探究，反復分析摸索，此過程可讓學生和教師都能有更多的收獲。最終獲得最佳實驗方案，也有助于指導后續(xù)實驗操作，順利完成實驗。