2010-2019 年北京市副溶血性弧菌臨床分離株血清型和耐藥性分析

曲梅 田祎 黃瑛 劉白薇 張新 呂冰 賈蕾 王全意

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus, VP)是沿海地區引起食物中毒和夏秋季腹瀉的首要病原菌。副溶血弧菌血清型復雜多樣。 目前,已知13 個O 抗原和79 個K 抗原[1],有71 種血清型可引起急性胃腸炎。 北京市雖為內陸城市,但近年來,由于飲食習慣和物流的發展,副溶血性血弧菌引起的腹瀉也呈上升趨勢。 由于抗生素的不規范使用和選擇壓力,細菌耐藥問題也日益嚴重,許多副溶血性弧菌臨床分離菌株出現多重耐藥現象[2,3]。 北京市自2010 年以來,在全市二級以上醫院腸道門診開展腹瀉病原學監測,為了解北京市副溶血性弧菌血清型變遷和流行特征,現將該市2010-2019 年副溶血性弧菌臨床分離株進行血清型和耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2010 年4 月-2019 年12 月,以北京市16 個轄區為監測點,每區每周采集10 份感染性腹瀉病人新鮮糞便樣本,全年每區最低監測量330 份,截止到2019 年12 月份,全市共收集46 249 份樣本。所有樣本進行副溶血性弧菌的分離、培養和鑒定。

1.2 方法

1.2.1 分離培養和生化鑒定: 分離培養參照《感染性腹瀉診斷標準》(WS271-2007 )附錄B.3 進行。 樣本接種于10 mL 含3% NaCl 的堿性胨水中,37 ℃增菌培養6 h。 增菌液劃線接種于科瑪嘉弧菌顯色瓊脂平板,置37 ℃培養18 ～24 h。 挑取可疑菌落,采用VITEK2-Compact 全自動微生物鑒定系統(法國梅里埃公司)進行系統生化鑒定。

1.2.2 血清分型: 采用診斷血清(日本生研公司)進行分型。 取一定量細菌于3%NaCl 鹽水中,121 ℃,處理30 min,離心10 min(4 000 r/min),棄上清。 取菌體,做O 抗原血清凝集試驗。 K 抗原鑒定:直接取濃菌懸液與多價抗K 血清按適當比例混合,出現凝集反應時再用單個抗血清進行檢測。 用生理鹽水做對照。

1.2.3 藥敏試驗: (1)2010-2011 年菌株藥敏試驗采用紙片擴散法(Kirby-Bauer,kB)進行,藥敏紙片及MH 培養基均為OXIOD 公司產品。 11 種藥物及抑菌環直徑(mm)判定標準:環丙沙星(CIP):耐藥(R)≤15,敏感(S)≥21 mm;氨芐西林(AMP):R≤13,S≥17;氯霉素(CHL):R≤12,S≥18;磺胺異噁唑(SUL):R≤10,S≥16;萘啶酸(NAL):R≤13,S≥19;頭孢唑林(CFZ):R≤14,S≥18;頭孢噻肟(CTX):R≤14,S≥23;阿莫西林-克拉維甲酸(AUG):R≤13,S≥18;四環素(TET):R≤11,S≥15;亞胺培南(IMP):R≤13,S≥16;慶大霉 素(GEN):R ≤12,S ≥15。 (2)2012-2013 年菌株藥敏試驗采用梅里埃VITEK2-Compact 全自動微生物鑒定系統GN-13 藥敏卡進行機器自動判讀,增加了臨床常用藥:復方磺胺甲噁唑(SXT)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢他定(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、氨曲南(AZM)、阿米卡星(AMI)、左氧氟沙星(LEV);減少了阿莫西林-克拉維甲酸(AUG)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、四環素(TET)等藥物。(3)2014-2019 年菌株藥敏試驗采用最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration,MIC)法,使用革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰生物技術有限公司)。 2014-2015 年使用的是單塊板包括16 種藥物,2016-2019 年使用的兩塊板包括28 種藥物。 增加了鏈霉素(STR)、頭孢西丁(FOX)、頭孢曲松(CRO)、多西霉素(DOX)、阿奇霉素(AZI)、吉米沙星(GMI)、卡那霉素(KAN)、米諾環素(MIN)、多黏菌素E(CT)、多黏菌素 B (PB) 等。 藥敏試驗均以大腸埃希菌(ATCC25922)做為質控菌株。 對三種及以上抗生素耐藥,既為多重耐藥(multidrug resistance,MDR)。 由于試驗方法的更新,藥物種類也在不斷調整,但所有研究結果都是以美國臨床實驗室標準化協會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)2017 年標準進行比較判讀,各試驗方法間和不同年代數據結果都具有可比性,按每兩年進行匯總統計。 (4)產超廣譜β-內酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases,ESBLs)判定標準:在初篩實驗(MIC 法)中頭孢他啶或頭孢噻肟MIC≥2 μg/mL;在ESBL 表型確證試驗(MIC 法)中,對兩組中任何一個藥物,在加克拉維酸后MIC 值與不加克拉維酸的MIC 相比,降低值≤3 個倍比稀釋濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件和WPS 2016專用版對數據進行統計處理。 計數資料以率表示,耐藥率比較采用χ2檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹瀉患者副溶血性弧菌分離情況 2010 年4 月-2019 年12 月收集腸道門診腹瀉患者糞便樣本46 249件,共檢出副溶血性弧菌1 853 株,檢出率為4.0%(表1)。 其中20 ～39 歲青壯年組副溶血性弧菌檢出率顯著高于其他年齡組,差異具有統計學意義(P ＜0.01)。 副溶血性弧菌感染患者的男女性別比為1.2 ∶1(1 002/851)。

表1 2010-2019 年北京市腹瀉患者不同年齡組副溶血性弧菌分離率、性別及主要血清型分布

表2 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌血清型分布

續表2

表3 2010-2019 年北京市副溶血性弧菌的藥敏結果

續表3

2.2 副溶血性弧菌血清分型 對1853 株副溶血性弧菌進行血清學分型,共檢測出9 個O 群,30 個K 抗原,鑒定出59 種血清型(表2)。 K 抗原缺失即KUT菌株較為常見,除了O6 群外,見于各O 群菌株。 O3 ∶K6型為優勢血清型1 254 株,占67.7%;O4 ∶KUT 型164 株,占8.9%;O4 ∶K8型113 株,占6.1%,位居血清型的第3 位。 前4 ～10 位血清型依次是O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9、O3 ∶KUT、O10 ∶K60、O1 ∶K36 和O4 ∶K6。其余血清型菌株數均不超過10 株。

不同年份血清型構成和分布隨著年代的更迭會發生變遷。 2010 年位居第二位的血清型為O4 ∶K9,2011-2012 年則主要是O4 ∶K8,而近些年又逐步被O4 ∶KUT 所趕超。有很多新的血清型出現:如O10 ∶K60自2013 年首次出現,連續幾年持續存在;罕見血清型O1 ∶K1,O3 ∶K30 為2019 年 新 出 現 血 清 型;另 外 每 年都會出現1 ～5 種僅檢出1 株的一過性血清型。

2.3 耐藥表型特征芐西林的耐藥率雖然較其他藥物處于較高水平,但呈現波動式下降:從2010-2011 年的96.8%到2014-2015 年的24.5%到2018-2019 年的17.1%,隨之相對應的是敏感率有上升的趨勢(表3)。 鏈霉素、阿莫西林-克拉維酸和磺胺異噁唑三種藥的耐藥率在2014-2015 年出現了異常的升高,分別為46.5%、30.2%和22.0%,之后有一個下降,隨后趨于平穩上升。 其他各類藥物雖然會出現不同年間的波動,但伴隨著敏感率的逐漸降低,耐藥率總體呈現逐漸增高趨勢。

2.3.3 多重耐藥及ESBLs: 對于耐三種以上抗生素的多重耐藥菌株,隨著年代的增加,檢測的抗生素種類增多,也呈上升趨勢,從2010 年的三重耐藥菌株9株(3.6%);到2014 年出現耐3 種以上抗生素達到32株(20.1%);甚至2018 年以后出現最多抗16 種抗生素的多耐藥菌株,各抗生素排列組合后有幾十種模式。 另外,2016 年以后出現了產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)菌株5 株。

2.3.1 藥敏概況: 對1 428 株副溶血性弧菌進行耐藥性檢測,總體情況:對氨芐西林和多黏菌素E 耐藥率最高,分別為51.5%和47.8%,敏感率分別為33.2%和52.2%(表3)。 其次對頭孢唑林和鏈霉素的耐藥率為22.9%和10.5%。 對頭孢西丁、頭孢噻肟和頭孢吡肟等二、三、四代頭孢會出現個別菌株的耐藥,但敏感率均達到99%以上。 對環丙沙星、左氧氟沙星和美洛培南無耐藥。 對其他各類抗生素的代表性藥,均有少量菌株耐藥。

2.3.2 耐藥率隨時間變化: 2010-2019 年菌株對氨

3 討論

血清型構成變化能反映種群的變遷,進而在一定程度上反映傳染源的變異。 既往研究缺少對北京市年度跨越大,系統全面的副溶血性弧菌血清型報道。本研究提供了北京市從2010-2019 年較為年完整的人源副溶血性弧菌血清型分布譜。 位于前7 位血清型分別為O3 ∶K6、O4 ∶KUT、O4 ∶K8、O1 ∶KUT、O2 ∶K3、O4 ∶K9和O3 ∶KUT,除O3 ∶K6外,與上海市、溫州市和我國東南地區人源菌株優勢血清構成還是有差異的[4],上海 以O3 ∶K6、O4 ∶K8、O1 ∶K25、O4 ∶K68、O4 ∶K9、O1 ∶K36 和O3 ∶K29 為主[5],溫州則以O3 ∶K6、O1 ∶K1和O4 ∶K1為主[6],與食源性菌株血清型差異性更大。前3 位優勢血清型中,均以20 ～39 歲年齡組所占比例最高。 這與青壯年做為社會主要生產力,外出就餐機會多、接觸病原體機會多有關[7,8]。 因此,應加強重點人群的監測,加強食品安全和公共衛生監管。

O3 ∶K6 血清型自1996 年被指定為大流行株,其他血清型 如O4 ∶K68、O1 ∶K25、O1 ∶KUT 和O6 ∶K18等,被認為是從O3 ∶K6大流行株演變而來并在亞洲和歐美等國家蔓延[9,10]。 本研究也在不同年份檢出這些血清型,說明這些流行血清型在北京也有散在傳播,造成人群感染。 另外,O4 ∶KUT 血清型近年呈明顯上升趨勢,國內有些地區已超過O3 ∶K6成為優勢血清型[11]。 O10 ∶K60 做 為 一 種 新 的 血 清 型,2013 年 首 次從日本的急性胃腸炎患者中分離得到,它的毒力基因、分子特征與大流行菌株高度一致[12],而本研究O10 ∶K60 菌株也分離自2013 年,之后每年都在人群中有散發,這種血清型的來源和傳播鏈還有待于從分子水平通過系統的基因組溯源研究來闡明。

通過本研究為期十年的耐藥監測,發現副溶血性弧菌耐藥性有上升趨勢。 對氨芐西林和多黏菌素E耐藥最嚴重,氨芐西林與多數研究結果一致[3,13],多黏菌素E 則未見報道。 對氨基糖苷類的鏈霉素存在一定程度的耐藥,卡那霉素則無耐藥,但其他文獻報道,水產品中分離到的副溶血性弧菌對卡那霉素和鏈霉素耐藥率都很高[13]。 本研究顯示對環丙沙星的敏感率高達99%以上,與其他地區報道的低敏感率、高耐藥率不同[13]。 2009-2013 年,我國東南沿海地區腹瀉患者分離株耐藥率普遍高,氨芐西林的耐藥率最高為87.1%,其次是頭孢西丁(56.9%) 和頭孢唑林(43.7%)且多重耐藥率高達28%[4],高于本次調查結果,亦明顯高于2007-2009 年來自四川、遼寧、浙江、廣西等地腹瀉患者分離的副溶血弧菌耐藥率[14]。 與血清型分布一樣,不同的研究結果存在異質性,除受菌株分離年代、不同來源背景及采取控制干預措施后會引起血清型和耐藥率的波動性變化等因素的影響,也說明在不同地區感染性腹瀉患者中,副溶血性弧菌型別和對抗生素的敏感程度有地域差異。 另外副溶血性弧菌人源分離株中有ESBLs 菌株,暗示質粒等可移動遺傳元件介導的耐藥基因的傳播及擴散,尤其是對氨芐西林抗性的影響,加速了多重耐藥菌株的出現。 對腹瀉患者采用抗生素藥物治療時,要充分考慮其不同區域之間存在的差異,結合藥敏試驗結果,確保臨床合理用藥,以降低耐藥菌株的產生。