黃芪根腐病致病菌分離與初步鑒定實驗應用于中職微生物學教學的探討*

蘇鋒鋒 趙曉霞 張雪瑩 耿 暉 周滿宏 閻少琴 牛世全**

（1 西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070 2 蘭州現代職業學院 甘肅蘭州 730300）

黃芪（Astragalus），多年生草本植物，是一種有滋補功效的傳統中藥；已有藥理臨床實驗報道表明，黃芪在免疫調節、抗病毒、抗腫瘤、糖尿病等方面具有重要作用［1］。作為重要的經濟中藥材在甘肅等省被大量種植。近年來，由于栽培、連作面積擴大，黃芪病害逐年加重，其中根腐病是影響黃芪產量和品質的病害之一。目前，已有研究表明，黃芪根腐致病菌主要是鐮刀菌（Fusarium），鐮刀菌屬是半知菌類瘤座孢目最大的屬，屬于寄生或腐生生活，分布廣泛，可侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐等多種病害。陳垣等［2］鑒定黃芪根腐病的致病菌主要是茄腐鐮刀菌（F.solaniun）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等；高芬等［3］研究表明黃芪根腐病的致病菌包括銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等。

黃芪根腐病發病過程是由根莖向下，由主根向側根蔓延。地上部分染病初期植株長勢弱，植株小，葉色轉為枯黃，嚴重時會脫落；地下部分根表面出現病斑且表皮粗糙，病斑發褐色且由大量的細紋組成，發病嚴重時表皮易被剝落，根系后期發黑潰爛，植株易被拔起。對病株的根部進行裝片制作觀察病根結構，發現病株維管束組織變褐色，有明顯被溶解的現象［4］。目前，對于黃芪根腐病的防治主要采用化學農藥防治措施，隨著生態環保的發展，取而代之的是生物防治技術［5］。分離黃芪根腐病的致病菌對該病的防治具有重要意義，本研究室對此持續開展了數年的研究工作。

1 學情分析

中職教育以學生綜合能力為導向，采用理論與實踐相結合的教學方法，培養技能型人才，這種教育理念為專業實驗課的開展提供了明確的方向，同時實驗教學對學生技能的培養有重要意義［6］。中職院校學生基礎知識總體欠佳，缺乏扎實的生物學知識，但動手能力比較強，對未知的知識充滿好奇心，通過教師正確的引導，可使學生的學習事半功倍。學生通過微生物學實驗1 的學習，基本了解了微生物的分離與純化實驗的操作，為學習本實驗做好鋪墊。在實驗過程中，各小組成員積極參與合作，教師激發學生發散思維，引導學生分析實驗現象和結果，幫助學生形成科學思維的習慣。

2 教學目標

1）知識目標：①學生通過查閱資料，了解植物病害病原微生物的種類、特點等知識。②熟練掌握病原菌分離純化的操作步驟、關鍵環節和注意事項。③能解釋分離培養實驗過程中各種現象產生的原因。

2）技術和能力目標：①學會組織分離法和平板劃線法等操作。②掌握病原菌分離的原理，并能規范操作。

3）情感態度與價值觀目標：①學生通過每一步嚴格的無菌操作，形成嚴謹、科學、務實的態度和精神。②通過小組合作完成，提高與他人溝通能力、口頭表達能力及團隊協作能力。③通過討論植物病原菌分離的意義，提高生態意識，形成可持續發展觀念。

3 實驗組織安排

為保證本實驗的順利進行，在課前充分研討的基礎上，作出以下安排。本次實驗教學將班級學生隨機分為5 組，每組5～7 人，選出1 位組長負責小組的實驗操作、組織討論與交流；其中2 位學生準備實驗材料和儀器，2 位學生負責查閱文獻資料，1 位學生做好實驗的記錄工作；實驗操作過程需每位成員合作完成。實驗全程在教師的指導下，學生積極參與其中，動手操作完成實驗。

4 實驗準備

1）材料與培養基：染病的黃芪病株，采自當地黃芪種植區；黃芪苗盆栽，由實驗室基地種植；馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）。

2）儀器與設備：電子天平、超凈工作臺、光學顯微鏡、全自動高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱等。

3）實驗方法：采用組織分離法、平板分離法［7］。

4）工作環境的清潔和消毒：分離培養在超凈工作臺中進行。先用紫外線燈照射20～30 min，之后將所需物品按次序置于工作臺上，避免工作時走動，工作人員穿滅菌后的工作服，戴口罩，并用70%酒精擦手。所有與分離材料接觸的器皿都要保持無菌，使用接種環時在酒精燈火焰上灼燒滅菌，培養皿、稀釋用蒸餾水需要提前進行高壓蒸汽滅菌。

5 實驗教學進程

5.1 組織分離 將染病的黃芪病株用無菌水沖洗、晾干，在病株根部的病健交界處（病原菌的生活力強、比較活躍，容易分離成功），用滅菌的小刀劃下面積為4～5 mm2的組織，用鑷子取下后先在70%的酒精中消毒5 s，后用5%的NaClO 溶液浸泡2 min，并用無菌水沖洗3 次，接種至PDA 培養基上，在27℃恒溫條件下持續培養5～7 d。

以上操作過程中，制作PDA 培養基、接種及從第3 天開始觀察和記錄菌落生長狀況，分別由一位學生負責。

5.2 菌種分離、純化 待菌絲長至成熟后，在超凈工作臺中酒精燈火焰旁，根據培養基內菌落的顏色差異及形態特征，用接種環以無菌操作挑取不同的菌落接于PDA 培養基上并編號，27℃恒溫條件下培養5～7 d。多次重復挑取不同的菌落接種于PDA 培養基上，重復劃線操作。在無菌條件下鏡檢，若僅能觀察到一種分生孢子，則說明已獲得了純培養，否則需繼續轉至PDA 培養基上進行純化，直至獲得純培養［8］。

以上操作過程，需要每位學生參與，依次輪流接種純化，直至純化為單菌落，并從第5 天開始各自觀察和記錄培養基內菌落生長狀況。

5.3 致病性檢測 根據病原菌分離、純化結果，采用黃芪苗盆栽回接實驗進行致病性檢測。選取長勢一致的健康黃芪苗，將幼苗移栽至裝有混合營養土的塑料小花盆中，每盆3 株，14 d 后采用離體根部接種法［7］，將分離、純化的供試菌株制成直徑4 mm 的菌餅接種于刺傷的健康黃芪根段，菌絲面貼于刺傷根部，每株分離菌株做3 次重復實驗，以僅刺傷的健康黃芪根段的幼苗為對照。光照培養箱內培養14 d 后，觀察病斑產生情況并記錄，依據柯赫法則［7］，對回接發病病斑部位重新分離、純化培養，觀察分離到的菌種與初接菌種是否一致，重新分離比率大于50%認為屬于致病菌［9］。

以上操作過程需要每位學生負責1～2 株菌，觀察并記錄根部產生病斑的情況。

5.4 病原菌初步鑒定 將分離純化的單菌落接種于PDA 培養基上，27℃恒溫培養箱中培養5～7 d后，通過培養基內菌落的形狀、大小、顏色、隆起及質地等指標觀察每種真菌的形態特性，依據顯微鏡鏡檢觀察真菌菌絲、分生孢子等形態特征，并結合真菌鑒定手冊［10］等相關資料對病原菌的分離地位進行初步鑒定。

以上操作過程需要小組內每位學生參與鑒定本組所分離出的病原菌，并且小組之間相互觀察所分離出的病原菌形態，并記錄。

5.5 組織進行實驗結果分析與討論 實驗結束后，由教師組織學生按小組進行討論。討論主要集中在2 個方面：1）黃芪根腐病病原菌的分離的意義；2）實驗中存在的問題。實驗結果不佳的小組，由小組成員共同分析討論實驗進程存在的問題，再由其他小組提出意見和建議，最終由教師總結評價實驗進行過程中的關鍵環節和注意事項。

6 實驗結果與分析討論

6.1 實驗結果 本次實驗中，有4 個組實驗結果良好，分離得到了單一的致病菌，通過回接致病性檢測，致病菌在接種14 d 后，實驗組黃芪幼苗的株高和主根長明顯小于對照組的株高和主根長，在實驗組黃芪幼苗主根上有明顯銹斑、變軟癥狀（圖1，本文附圖見封四）。對回接發病病斑部位重新分離、純化培養，觀察分離得到的菌種與初接菌種一致，重新分離比率為100%，初步認為該4 株菌為黃芪根腐病的致病菌，分別編號為G2、G5、G6、G9。根據菌落大小、顏色、形態，菌絲體及孢子形態等特征，可初步鑒定G2、G5、G6、G9均為鐮刀菌屬（圖2、圖3和表1），本研究結果與已報道的黃芪根腐病的病菌一致。

表1 病原菌形態特征

6.2 實驗分析與討論 對于微生物病原菌分離實驗，無菌操作是影響實驗結果的關鍵因素，一些學生對無菌操作認識不足，操作不熟練，導致培養基被雜菌污染。無菌操作是本實驗的核心，主要包括3 個方面：①無菌環境，包括無菌室和無菌柜、超凈工作臺等。②無菌器材，包括實驗過程中使用的玻璃器皿、金屬器材等的滅菌和消毒。③無菌操作技術，微生物學實驗過程中熟練地掌握各種無菌操作最為關鍵，例如實驗操作均應在火焰旁進行，充分利用火焰周圍的高溫區（無菌區）；挑取和移接微生物純培養物用的接種環及接種針，使用時用火焰充分灼燒滅菌；轉移液體純培養物時，應采用無菌吸管或無菌移液器等。實際上，人工創造的無菌環境條件只是相對而言，不可能保證環境的絕對無菌，因此，在實驗過程中為保證不被其他微生物污染，關鍵是要嚴格進行正確的無菌操作，熟練掌握各種無菌操作技術。

7 實驗教學活動總結與反思

7.1 學生收獲

1）知識方面：通過實驗，掌握了病原菌分離純化的操作步驟、關鍵環節和注意事項，并能對實驗過程中產生的各種現象作出解釋。

2）技術和能力目標方面：通過該實驗，學會了高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺等實驗儀器設備的使用，掌握了組織分離法和平板劃線法等實驗方法，并能規范地進行無菌操作。

3）情感態度價值觀方面：通過實驗操作，形成了嚴謹、科學的態度，具有了團隊協作的精神，提高了生態意識，形成可持續發展觀念。

7.2 實驗教學反思

1）明確實驗目的，規范實驗操作。明確實驗的重要意義和作用，將其與應試教學相區別。讓學生親自動手操作，避免出現越俎代庖“講實驗”的現象，實驗課重在對實驗過程的分析與總結。教師在實驗過程中，需時刻關注學生的行為，及時點撥指導，規范學生實驗操作，有效管理學生，既調動學生的主動性、積極性，又能達到預期的目標，使實驗課變得更加高效，為今后的實驗操作和學習奠定良好的基礎。

2）激發學習興趣，培養學習能力。實驗過程中根據實驗目的創設相關疑問，讓學生帶著疑問進行實驗，不僅增強了學生學習興趣，還使其在實驗過程中更加積極主動；學生之間進行自主交流，思維碰撞，引導學生深入思考，例如，“進行組織分離為什么要選擇新鮮病材并且在病健交界處取樣？”。實驗教學不能拘泥于教材內容，要激發學生的多向思維，培養學生發現問題并解決問題的能力。

3）重視因材施教，加強小組合作。學生的學習基礎、學習能力、心里素質都不同，而對于中職院校學生更是如此，為了更好地達到實驗教學目標，教師應因材施教，明確分工，對于較為陌生的知識，應采用更加通俗，易于理解掌握的教學實驗方式。而實驗更離不開各小組成員的協助配合，例如，“病原菌純化培養的實驗過程”，需要小組成員全部參與到實驗中，共同完成實驗內容，體驗參與實驗的樂趣。