第28屆國際生物學奧林匹克競賽試題實驗2·生物化學

2020-04-15 09:36:26佟向軍王戎疆張雁云范六民

生物學通報 2020年5期

佟向軍王戎疆張雁云杜軍范六民

（1 北京大學生命科學學院北京 100871 2 北京師范大學生命科學學院北京 100875 3 中國人民大學附屬中學北京 100080）

總分：78 分時間：120 min

本實驗考試包含3 個問題，請按照下述順序完成實驗：

問題1:分析血液標志物（11 分）。本實驗約耗時15 min,將提供一些數(shù)據(jù)請你分析。

問題2：動力學參數(shù)的實驗測定（60 分）。本實驗約耗時90 min，你將得到自己的實驗結(jié)果。

問題3：遺傳標記分析（7 分）。本實驗約耗時5 min，將提供一些數(shù)據(jù)請你分析。

本考試中，你將通過血液標志物、酶動力學和一種遺傳病的家族遺傳分析一位病人的病史。

重要信息：

●在給定的框中寫下你的姓名、學生代碼和國家；

●請在答題紙上填寫答案，這樣才能得分；

●確定已收到列出的所有材料和設備；如果缺少任何物品，請立即舉綠牌示意；

●實驗過程中，請確保正確操作設備；由于自己的原因不慎灑出液體或損壞設備，將不予補充；

●在考試結(jié)束哨聲響起時，請立即停筆；

●考試結(jié)束后，請將答題紙留在桌子上；

●不得將紙張、材料或設備從實驗室?guī)С觯?/p>

●英文原件可應要求提供。

材料：冰盒；溶液A：2×溶液的反應母液，含有：50 mmol／L 磷酸鉀緩沖液，pH=7.6；14 mmol／L MgSO4；2.64 mmol／L ADP；40 U 乳酸脫氫酶；0.4 mmol／L NADH （10 mL）（在冰盒里）；溶液B：H2O（10 mL）；溶液C：10 mmol／L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）溶于0.1 mol／L 磷酸鉀緩沖液，pH=7.6（1.5 mL）（在冰盒里）；血漿稀釋液F、M 和D（每個0.5 mL）（在冰盒里）；1 支20～200 μL 移液器；1 支100～1 000 μL 或200～1 000 μL 移液器；適合移液器的吸頭；1 mL 塑料比色皿（1 cm 光程）×20；盛放廢棄吸頭和比色皿的垃圾桶；1 臺可見光分光光度計；查閱分光光度計的說明書（另外的單獨文件），將指導你使用分光光度計；置于樣品室的1 個比色皿以指示正確的方向；1 個比色皿架；方形封口膜×30；數(shù)字式計時器；30 cm 尺子；計算器；鋼筆；鉛筆。

重要背景信息：丙酮酸激酶（PK）是一種58 kDa 的蛋白，以同源四聚體的形式起作用，在糖酵解途徑中起關(guān)鍵作用（圖1）。在反應中，將其底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ATP。

PK缺乏癥（PKD）是遺傳性非球形細胞溶血性貧血的最常見原因，是一組與紅細胞凈損失相關(guān)的遺傳性疾病。在PKD 病癥中，紅細胞在成熟前裂解（經(jīng)歷溶血），導致紅細胞不足（貧血）。在遺傳性非球形細胞溶血性貧血中，紅細胞不像其他形式的溶血性貧血呈現(xiàn)球形。血液分析也有助于了解PKD疾病。此外，該疾病通常與網(wǎng)織紅細胞增多癥（即未成熟紅細胞——網(wǎng)織紅細胞數(shù)量增加）有關(guān)。

PKD遺傳于常染色體隱性模式。具有常染色體隱性病癥個體的父母可能會或不會顯示病情的體征和癥狀，取決于他們擁有的等位基因。

假定亞基表達量相同且隨機關(guān)聯(lián)，簡單雜合子或復合雜合子（雜合子中有2 個不同的隱性等位基因）中，PK 四聚體同工酶（A4，A3B，A2B2，B3A，B4）的理論比值為1∶4∶6∶4∶1。如果B 是變體，A 是正常的，則PKD 患者體內(nèi)所有PK 四聚體中約94%含有一個或多個突變的亞基；未組裝的單體易被蛋白酶降解。重要的是，要注意一些特定的等位基因編碼的PK 蛋白形成四聚體，而其他等位基因編碼的PK 蛋白則保持單體形式。

通常在簡單雜合子、復合雜合子和純合子中觀察到的臨床癥狀是可變的，從需要輸血的新生兒黃疸，到能自我調(diào)節(jié)、只顯示最小臨床癥狀的溶血性貧血。根據(jù)有缺陷酶的生物化學特征，已經(jīng)鑒定了許多突變型PK。

圖1 丙酮酸激酶的功能

臨床情境：已診斷出很多家庭成員患有非球形細胞溶血性貧血，可能與PK 缺乏有關(guān)。可進行許多測試，包括血液測定以確定血液組成的參數(shù)（血液圖）和專門用于PK 活性的血漿酶分析。此外，可進行遺傳分析，包括鑒定個體的PK 蛋白，以及通過家系分析確認可能的遺傳模式。

你將分析和收集3 名家庭成員的數(shù)據(jù)：父親（F）、母親（M）和女兒（D），以確定家系。

問題1：血液分析

從父親（F）、母親（M）及其女兒（D）收集全血樣本。取血并分析后，獲得以下這部分結(jié)果（表1）。

表1

可進行各種分析，包括測定血細胞比容，即紅細胞堆積的體積占總血量的百分比。通過將血液樣品吸入微量毛細管并離心，使紅細胞沉淀在一起，再通過測量毛細管中堆積在一起的紅細胞占總體積的比值，計算紅細胞的百分比。

任務1a

確定圖2所示的每個人的血細胞比容（堆積的紅細胞占總體積的百分比）。將這些數(shù)據(jù)填寫在表3的第1 行中,以百分比表示,小數(shù)點后保留1 位有效數(shù)字。

圖2 父親、母親及女兒的血細胞比容圖

表2 健康人的血液圖正常值

任務1b

使用圖2的堆積細胞體積和表1的患者數(shù)據(jù)，計算每位患者（F、M 和D）的以下參數(shù)：紅細胞體積，稱為平均細胞體積（MCV）；每個紅細胞血紅蛋白的質(zhì)量，稱為平均細胞血紅蛋白（MCH）；MCV 以飛升（fL，1 fL=1×10-15L）為單位，小數(shù)點后保留1 位有效數(shù)字；MCH 以皮克（pg，1 pg=1×10-12g）為單位，小數(shù)點后保留1 位有效數(shù)字；MCHC 是RBC 這部分中血紅蛋白總濃度，以克/分升（g／dL，1 dL=0.1 L）為單位，小數(shù)點后保留1 位有效數(shù)字。

請在方框1 中填寫計算所得父親（F）的每個參數(shù)值，并在表3中填寫父親（F）、母親（M）和女兒（D）各參數(shù)的相應數(shù)字。

方框1 患者F（父親）的計算結(jié)果（4 分）

表3（4 分）

進一步分析：根據(jù)紅細胞的大小，將貧血癥分為正常細胞（正常MCV）、大細胞（增加的MCV）或小細胞（降低的MCV）貧血。基于外周全血涂片檢查，小細胞貧血也常被描述為低血色素貧血。小細胞小而薄的光學性質(zhì)，使其在血涂片上顯示為低著色，而血紅蛋白濃度保持在正常范圍（小細胞貧血；低色素性貧血）。正常血色素血液的血涂片無光學性質(zhì)的變化，血紅蛋白的濃度也在正常范圍。

表2提供了MCV 和MCHC 的正常范圍。

任務1c

使用你獲得的數(shù)值（包括在表3中），根據(jù)血細胞的大小及樣品F、M 和D 的血液中血紅蛋白水平進行分類。

對每位患者，請從以下選項中選擇其一回答（注意：任何選項均可多次使用）：

A．大紅細胞，正常色素

B．小紅細胞，低色素

C．正常細胞，正常色素

（3 分）

問題2：測定丙酮酸激酶活性

利用生物化學方法，通過研究酶的動力學變化，可了解酶的性質(zhì)。酶活性通常通過監(jiān)測底物的消失或產(chǎn)物的產(chǎn)生進行確定，通常使用反應混合物的分光光度特性的變化確定底物和產(chǎn)物的變化。

通過耦聯(lián)測定方便地測定PK，其中反應產(chǎn)物丙酮酸（方程式1）用作NADH 耦聯(lián)的乳酸脫氫酶（LD）（方程式2）的底物。該酶以足夠的量加入到反應混合物中，使反應期間產(chǎn)生的所有丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸。可通過340 nm 光吸收值隨時間的減小監(jiān)測反應。耦聯(lián)反應的反應方程式見圖3。

圖3 丙酮酸激酶（PK）和乳酸脫氫酶（LD）催化的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）（方程式1）和丙酮酸（方程式2）的分解

可通過改變PEP 底物濃度確定酶的動力學性質(zhì)（方程式1）。

實驗目的：確定3 位患者，父親（F）、母親（M）和女兒（D）血漿樣本中PK 的功能。

●通過使用耦聯(lián)測定法測定患者血漿樣品中PK 的活性。

●計算PK 的動力學性質(zhì)，以絕對單位表示。

方法:丙酮酸激酶測定開始前,請注意以下事項：

1）溶液A、C 和患者樣本F（父親）、M（母親）、D（女兒）應保持在冰上，溶液B（H2O）保持在室溫。

2）分光光度計應該在340 nm 波長處使用水（已提供）做空白對照。

3）通過表4所示的試劑，直接吸取至1 mL的塑料比色皿中制備反應混合物。你應該添加除血漿樣品以外的所有成分，然后在準備開始反應時，最后添加血漿樣品。

表4 丙酮酸激酶實驗試劑

任務2a

計算5 個濃度的PEP（溶液C）（從0.2～1.5 mmol／L中選取5 個濃度）所需PEP 的反應體積。在方框2 中填寫最高濃度的計算示例。PEP 將推動反應進行,以測定每個血漿樣品［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］中的丙酮酸激酶活性。

方框2（1 分）

任務2b

將用于使反應混合的體積填入表5中的空白處；注意：對于每個血漿樣品（F、M 和D）都相同。

你應該在表5每一列的頂部填寫上你決定用的底物濃度PEP［S］，以及在各相應框中填寫每個溶液所用的體積。

表5 反應體積（3 分）

PK 活性測定

通過反復顛倒比色皿混合內(nèi)容物（確保使用拇指或食指將一塊封口膜壓緊在開口處），在零時間點讀取A340讀數(shù)，然后以30 s 的間隔記錄A34090 s。記錄下分光光度計上顯示的吸光值。

對于每個樣品，需要確定你使用各濃度PEP（［S］）時的初始反應速率ΔA／Δt（時間以min 表示），用零時間點值和另一個選擇的數(shù)值。在數(shù)值上畫圈以突出顯示你用于計算速率的時間點范圍。

任務2c

按所描述進行實驗，并使用提供的表記錄吸光度讀數(shù)（表6.1、6.2 和6.3）。

動力學參數(shù)計算：隨著時間的推移，產(chǎn)物/底物濃度的變化可通過吸光度的變化表示。對于每個初始速率ΔA／Δt，計算每個PEP 底物濃度（［S］）的反應初始速度V0（ΔConc／Δt）。反應用Beer-Lambert定律給出速度絕對單位應為μmol／min。Beer-Lambert 定律（或Beer 定律）是吸光物質(zhì)的吸光度和濃度之間的線性關(guān)系。公式為：A=εlc，其中A為光吸收，ε為摩爾消光系數(shù)，l為光程，c為濃度。

該實驗測量NADH［摩爾消光系數(shù)為6 220 L／（mol·cm）］向NAD+（其在340 nm 具有可忽略的吸光度）的轉(zhuǎn)化，即PEP 向乳酸的轉(zhuǎn)化。由于組分摩爾比為1∶1，因此，NADH 的轉(zhuǎn)化率等于PEP 的轉(zhuǎn)化率。比色皿光程長度為1 cm。

任務2d

計算初始速度（V0），將每個病人［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］的答案填入下表（表7.1、7.2和7.3），保留3 位小數(shù)。

表6.1 樣品F（6 分）

表6.2 樣品M（6 分）

表6.3 樣品D（6 分）

表7.1 患者F（1 分）

表7.2 患者M（1 分）

表7.3 患者D（1 分）

計算酶參數(shù)KM和Vmax

通過不同底物濃度的不同酶促反應速率，可確定2 個酶參數(shù)：KM和Vmax。這2 個參數(shù)可通過以下2 種方法之一進行估算：Michaelis-Menten 圖（圖4A）或Hanes-Woolf 圖（圖4B）。

圖4 動力學數(shù)據(jù)圖

任務2e

使用你從每位患者（F、M 和D）獲得的數(shù)據(jù)，在下面的坐標紙上，以V0對［S］各做一張Michaelis-Menten 圖。你應該將3 個數(shù)據(jù)圖繪制在一張坐標紙上：父親（F）、母親（M）和女兒（D）各一個數(shù)據(jù)圖。用“×”標記來自父親（F）的數(shù)據(jù)，用“○”標記來自母親（M）的數(shù)據(jù)，用“△”標記來自女兒（D）的數(shù)據(jù)。

Michaelis-Menten 圖（10 分）

任務2f

使用3 個數(shù)據(jù)圖，估計Vmax和KM；使用正確的單位在下表中填入圖中每個樣本的估計值，保留2 位小數(shù)。（6 分）

任務2g（3 分：每完成一個表1分）

對每個樣品的每個底物濃度，確定［S］／V0，并將每位患者［父親（F）、母親（M）和女兒（D）］的答案寫在下表中。估算值保留2 位小數(shù)。

患者F （1 分）

患者M （1 分）

患者D （1 分）

任務2h

對于每位患者（F、M 和D），在下面的坐標紙上，以［S］／V0作圖。你應該將3 個數(shù)據(jù)圖繪制在一張坐標紙上：父親（F）、母親（M）和女兒（D）各一個數(shù)據(jù)圖。對于每個數(shù)據(jù)圖，擬合一條最佳直線。用“×”標記來自父親（F）的數(shù)據(jù)，用“○”標記來自母親（M）的數(shù)據(jù)，用“△”標記來自女兒（D）的數(shù)據(jù)。

Hanes-Woolf 圖（10 分）

任務2i

計算每位患者的Vmax和KM，并使用正確的單位填入下表，保留3 位小數(shù)。（6 分）

?患者 Vmax KM父親（F）母親（M）女兒（D）

問題3：遺傳分析和診斷

將父親、母親和女兒的血樣送至臨床檢測實驗室進一步分析。從全血中提取蛋白質(zhì)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后（western blot），使用酶聯(lián)抗PK 抗體和化學發(fā)光檢測使樣品顯像。所得PK 蛋白含量見圖5，請參閱重要背景信息以幫助理解圖像。