蛋白激酶抑制劑B對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

張丹鳳 李晶 于海波 竇鵬揮 肖曉超 薛晴

(佳木斯大學 1附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154007；2基礎醫學院；3佳木斯市婦幼保健院；4佳木斯大學臨床醫學院)

卵巢癌為婦科腫瘤首位的三大惡性腫瘤之一，據統計，每年全世界大約新發病例23.9萬〔1〕，死亡患者超出15萬人次〔2〕，5年生存率只有30%〔3〕。通常其發生發展可能與相關腫瘤蛋白刺激卵巢上皮細胞增殖、異常分裂及細胞因子的改變有關。作為蛋白激酶抑制劑(PKI)家族中新的耐熱蛋白PKIB，與多數腫瘤關系緊密，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，特別是其在乳腺癌細胞增殖中發揮效應。目前PKIB低表達對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移影響的研究報道較少。本研究分析PKIB低表達對卵巢癌細胞增殖、侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1細胞來源 卵巢癌細胞株A2780細胞購于美國菌種保藏中心(ATCC)。用MCCOY 5A和 RPIM1640 完全培養基培養，37℃，5% CO2培養，培養基更換時間依細胞狀態來確定(每天或隔天)，實驗取對數期生長較好的細胞(形態、形狀、期別等)。

1.2細胞轉染 將A2780細胞懸液種于6孔板中，融合度為70%～90%且需細胞貼壁。每孔的轉染試劑混合液為質粒2 μg(siRNA 15 μl)+轉染試劑6 μl+無血清無雙抗RPMI1640 200 μl。靜置20 min于冰上。先逐孔丟棄細胞原培養液，后加入200 μl轉染試劑混合液及培養基1.3 ml(含10%血清的RPMI1640)。需輕搖動混勻，培養在培養箱中(環境37℃、含5%CO2)。72 h后取總蛋白備用。

1.3試劑 PKIB抗體購于美國 Abcam(Cambridge，MA，USA)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自DAKO，免疫組化抗原修復液乙二胺四乙酸(EDTA)購自中杉金橋生物公司，山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、焦碳酸二乙酸(DEPC)試劑購自武漢博士德生物技術有限公司，ABI PRISM 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)，高速低溫冷凍離心機購自Heraeus，光學顯微鏡購自奧林巴斯公司。

1.4CCK-8 細胞生長實驗 把轉染后的細胞進行常規消化、離心、重懸、計數，在 96 孔板內行細胞接種(1 000個/孔)，需設 4 個復孔處理每組細胞后在培養箱內孵育細胞。10%CCK-8滴加時間是6 h、第 1、2、3、4、5 天，孵育2 h(避光、37℃)，測 450 nm的吸光度(OD)值(用酶標儀操作)。重復操作3次上述實驗。

1.5細胞侵襲能力檢測 采用Matrigel小室進行，人卵巢癌細胞接種到上室以1×104/孔的密度，下室接種巨噬細胞以 1×104/ 孔的密度。培養3 d，取出小室濾膜下表面的細胞，離心后重懸于100 μl的PBS，甩片。先行細胞涂片干燥、染色，侵襲細胞數量用熒光顯微鏡觀察和計數。

1.6細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 細胞密度要求5×108/L，用6孔板接種，在溫箱孵育過夜(5%CO2)，細胞匯合度要達到100%。記號筆在每個孔的背面做好劃痕標記，便于數據獲取時保持位置一致。垂直于標記線快速進行劃痕采用無菌槍頭。反復沖洗細胞孔以去除懸浮細胞(用PBS)。在37℃、5%CO2條件下孵育，前提是在培養孔內加入不含血清的DMEM培養基。取樣依據時間設計點，顯微鏡下拍照，先測定劃痕的初始距離(0 h)；按照時間設定要求依次測定劃痕距離并拍照儲存后計算細胞遷移率，重復3次上述實驗過程。

1.7統計學分析 應用SPSS15.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1PKIB對卵巢癌細胞增殖的影響 PKIB shRNA組24、48、72 h細胞增殖能力明顯高于NC組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組培養不同時間后細胞增殖能力值，n=4)

與NC組比較：1)P<0.05

2.2侵襲能力檢測 PKIB shRNA組侵襲穿膜細胞數〔(101+27)個〕明顯高于NC組〔(47+12)個〕(P<0.05)。見圖1。

2.3遷移能力測定 PKIB shRNA組遷移能力明顯加強，48 h遷移率為67.9%，而NC組48 h遷移率為43.1%，組間差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖1 兩組A2780細胞侵襲(×200)

圖2 兩組細胞遷移(×40)

3 討 論

一般情況下，腫瘤患者有自覺癥狀發現大多數已是晚期，治療難度增加，再加之化療產生的耐藥及出現的轉移和復發〔4〕，對患者身心帶來莫大的傷害和壓力〔5～7〕。由于腫瘤的轉移增加了患者死亡的概率，而這種轉移和侵襲性又受到很多因素、大量基因控制和影響〔8～10〕。鑒于以上原因，目前臨床治療的關鍵就在于探究卵巢癌的轉移和分子機制，進而實施基因靶向治療〔11〕。現今RNA干擾技術是研究的熱點〔12〕，其有益之處在于特異性強、可同時抑制多個基因且療效明顯，具有廣闊的應用前景和臨床價值〔13,14〕。

與腫瘤發生、發展密切相關的還包括腫瘤微環境中炎性因子〔15〕。作為由78個氨基酸殘基組成的PKI家族的成員之一的新型耐熱蛋白PKIB，最早是從兔睪丸中分離得到，有學者證實在大鼠和人組織中也存在該蛋白〔16〕。通常，大多數腫瘤的生物學行為都與PKIB有關。本研究結果顯示：PKIB 低表達可加強細胞的增殖，由此證明PKIB 參與卵巢癌細胞的增殖并且起促進作用。通常侵襲和轉移也是癌癥患者死亡的一個主要原因。本實驗表明PKIB表達對卵巢腺癌細胞的侵襲起重要作用。PKIB 低表達增強卵巢癌細胞侵襲和遷移能力。PKIB 作為原癌基因參與調節卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移，但其作用機制和相關信號轉導通路的確定還需進一步研究。