miR-34a/Bcl-2在聽神經皮層的表達及調控

葉詠怡 黃秋紅 鄭億慶

(中山大學 1孫逸仙紀念醫院耳鼻喉-頭頸外科，廣東 廣州 510120；2聽力及言語研究所)

年齡相關性聽力損傷，又稱老年性聾，在老年神經退行性疾病中占主導位置，約40%的65歲以上老年人群受到影響〔1〕。微小核糖核酸(miR)-34a作為一個重要的轉錄因子，近年來被發現在細胞增殖、分化、凋亡中扮演重要角色〔2〕。目前B淋巴細胞瘤(Bcl)-2是凋亡基因家族研究的主要靶分子，被視為一個重要的抗凋亡蛋白〔3〕。本研究旨在探討miR-34a、Bcl-2在原代培養聽皮層神經元中的凋亡機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 細胞原代培養使用出生24 h內C57BL/6J乳鼠，成年動物組織使用4周齡與12月齡C57BL/6J小鼠，均由中山大學實驗動物中心提供。

1.2培養板及培養皿的處理 15 mm×15 mm無菌爬片放入24孔板中，100 μg/ml多聚-D-賴氨酸加入培養皿及6孔、24孔培養板中，覆蓋爬片及板的表面，放進5%CO2培養箱37℃包被過夜；實驗前回收包被液，用Hank平衡鹽溶液(HBSS)洗1次，待風干后種板用。

1.3聽皮層神經元細胞的原代培養 細胞提取方法參照文獻〔4〕，并對其改良優化。取出生24 h內的乳鼠，用75%酒精消毒后，無菌環境下斷頭法處死后，剪開頭部皮膚，延大腦中部剪開腦膜，用無菌精密尖彎頭鑷子把腦膜外兩邊剝開，將整個大腦取出放進含血清培養基的培養皿中；用滅菌后精密尖頭鑷子在預冷含血清培養基中清除血管膜和微細血管；定位參照文獻〔5〕，根據定位，用滅菌后精密尖頭鑷子取出聽皮層位置的組織，放進含血清培養基的培養皿中，直至收集全部聽皮層組織。吸出含血清培養基，用HBSS緩沖液洗1次，加入2 mg/ml的木瓜蛋白酶(含100 μl DNA Ⅰ酶)，放入5%CO2培養箱中37℃消化20～30 min，每5 min取出搖晃一次；從培養箱取出后，把木瓜蛋白酶吸出，加入2～3 ml含100 μl DNAⅠ酶的血清培養基停止消化，把培養皿中的組織及培養基吸進15 ml離心管里，靜置3～5 min；吸出上層培養基，加入2 ml無血清神經元培養基，靜置2 min；吸出上層培養基，加入無血清神經元培養基至離心管的5～6 ml刻度處，緩慢輕輕吹打10次，讓組織分散不粘連，靜置2 min后，小心輕輕吸出上層1～2 ml細胞至另一個無菌離心管中，重復2～3次，提取出細胞懸液。用細胞計數板得出細胞數量，并進行種板。種板后4～12 h內全量換無血清神經元培養基，每3 d半量換液。

1.4不同培養時間點神經元形態學的觀察 種板12 h內全量換無血清培養基后，在普通倒置顯微鏡觀察剛貼壁的神經元細胞形態，之后每天觀察神經元細胞的生長變化情況，連續觀察10 d。

1.5神經元特異性核蛋白(NeuN)免疫熒光進行神經元鑒定 24孔板爬片種板后，待3～4 d，聽皮層神經元細胞長出突觸，固定30 min后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加0.5% Triton-X100破膜15 min，PBS洗1次，10%山羊血清封閉30 min，耳蝸細胞株細胞條件空白對照組、內參組及過表達組神經元細胞加NeuN一抗(1∶100)，陰性對照只加抗體稀釋液，4℃靜置孵育36 h后取出，PBS洗滌，避光分別加二抗羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(1：200)及二抗羊抗鼠(1：200)室溫1 h，PBS洗滌，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光復染5 min，PBS洗滌，在載玻片上滴適量抗熒光淬滅劑，把細胞貼在爬片的那一面蓋在載玻片上，至正置熒光顯微鏡觀察。

1.6NeuN在C57BL/6J小鼠大腦冰凍切片的免疫熒光 10%水合氯醛麻醉后，脫臼法處死，取不同年齡的大腦組織，立刻室溫固定6～8 h，20%、30%梯度蔗糖溶液4℃脫水3～4 d后，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物(OTC)包埋，切片厚度8～10 μm，-80℃保存。切片加1% Triton-X100破膜15 min，PBS洗滌，10%山羊血清封閉30 min，大腦切片分別加NeuN一抗(1∶100)，陰性對照只加抗體稀釋液，4℃孵育過夜；從4℃取出，PBS洗滌，避光各加二抗羊抗兔IgG(1∶200)室溫1 h，PBS洗滌，DAPI復染5 min，PBS洗滌，在載玻片上滴適量抗熒光淬滅劑，蓋上載玻片，至正置熒光顯微鏡觀察；在低倍鏡先找到海馬，順著海馬找到定位聽神經位置；設視野中的細胞為總量n，NeuN標記數為x，神經標記細胞百分率=(n/x)×100%，比較兩者神經細胞形態及數量的差異。

1.7Western印跡法檢測蛋白表達 取4 w齡和12月齡的C57BL/6J小鼠的大腦組織，定位聽皮層位置用高溫高壓消毒后的直眼科剪取出組織，放進蛋白質抑制酶(100：1)裂解提取蛋白。聽皮層神經元細胞貼壁6孔板生長5～6 d后，每孔(5～10)×105細胞密度，加入20 μmol/L、40 μmol/L的miR-34a過表達試劑，進行瞬時轉染72 h。轉染完成后，加入蛋白質抑制酶(100：1)裂解提取細胞蛋白，4℃，14 000 r/min，離心30 min，提取上清液；用BCA法定量。取20 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。先用GAPDH(1∶10 000)和Bcl-2(1∶1 000)一抗，4℃過夜；后用辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗進行免疫雜交；滴加超敏發射極耦合電化學發光液(ECL)，用智能成像系統 (G：BOX XT4)曝光，得到蛋白條帶使用Image J進行灰度計算并統計分析。

1.8統計學分析 采用SPSS25.0軟件對服從正態分布且方差齊性的數據進行t檢驗，對不符合參數檢驗條件的數據進行秩和檢驗。

2 結 果

2.1神經元形態學觀察 神經元細胞提取12 h基本全部貼壁，可觀察幼稚的神經元細胞呈圓形，胞體周圍光暈明顯，突觸開始生長;培養3～4 d后，胞體變大且更飽滿，胞核明顯，突起數量增多且增長，突起之間開始相互連接;培養6～8 d，神經元細胞基本趨于成熟，各神經元間有聚集傾向;培養10 d后，胞體周圍光暈開始變暗，樹突數量更多分布更廣，逐漸形成復雜的網絡結構。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察不同培養時間的神經元細胞(×200)

2.2NeuN在不同年齡C57BL/6小鼠大腦切片的形態及數量 4周齡與12月齡鼠大腦切片聽皮層神經位置DAPI細胞核復染在熒光顯微鏡下顯藍色熒光(見圖2A與D)；4周齡與12月齡鼠大腦NeuN神經元特異性核蛋白染色顯紅色熒光(見圖2B與E)；4周齡與12月齡鼠大腦細胞核、神經元核蛋白染色合并(見圖2C與F)。4周齡小鼠聽神經細胞百分率顯著高于12月齡〔(72.2±2.2)% vs (44.5±1.9)%,P<0.001,n=3〕。

2.3不同年齡C57BL/6小鼠大腦聽皮層組織Bcl-2蛋白 4周齡鼠Bcl-2蛋白表達(0.92±0.10)顯著大于12月齡(0.62±0.04，P<0.05，n=3)。見圖3。

2.4神經元細胞轉染后Bcl-2表達結果 空白對照組及內參組Bcl-2表達量分別為：0.370 9±0.003 2、0.417 1±0.006 4。促表達試劑濃度在20 μmol/L時，與陰性對照(20 μmol/L)組比較，Bcl-2蛋白表達量顯著減少(0.403 1±0.007 4 vs 0.511 2±0.001 4，P<0.05)；進一步增加促表達試劑濃度至40 μmol/L時，Bcl-2蛋白表達量與陰性對照(40 μmol/L)組顯著減少(0.328 1±0.001 9 vs 0.494 0±0.008 7,P<0.001)；提示符合miR通過與靶基因mRNA互補結合從而抑制靶基因表達的作用方式。 見圖4。

圖2 NeuN神經元標記物的鑒定(×40)

圖3 不同年齡小鼠聽皮層中Bcl-2蛋白的相對表達

1～6：空白對照組、內參組、陰性對照(20 μmol/L)、過表達(20 μmol/L)、陰性對照(40 μmol/L)、過表達(40 μmol/L)

3 討 論

聽皮層是聽覺系統的高級中樞，能對傳入的聽覺信號進行加工、編碼、分析，把電信號轉換成言語的處理器，對中樞性耳聾及言語識別率低下的相關疾病的研究具有重要意義，而聽皮層神經元的獲得，是深入進行分子生物學研究的重要前提。通過對聽皮層的準確定位及聽皮層神經元的原代培養，能彌補動物在體內實驗無法實施的一些實驗條件。

miR-34a是一種內源性非編碼miR，被視為重要的轉錄因子〔6〕。隨著研究者對miR的深入研究，發現在疾病發展的過程中，根據靶基因在其發揮的作用，miR的變化可作為抑制和促進因子，從而調控疾病的發生與發展〔7〕。研究發現miR-34a基因表達在衰老過程及其相關疾病中起到了一定作用〔8〕。研究表明，Bcl-2在哺乳動物的健康和疾病中擔當重要角色〔9〕，是一種細胞內的膜相關蛋白，可抑制細胞凋亡〔3〕。因此，本文推測miR-34a、Bcl-2信號通路在不同年齡C57BL/6J小鼠的聽皮層神經元上細胞凋亡和聽力損失機制有著緊密的聯系。

miR可通過與靶mRNA的3′UTR互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與其不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白質的合成〔10〕，研究表明miRNA的調節異常可導致Bcl-2家族蛋白的不平衡和線粒體功能障礙〔11〕，因此在基因表達中發揮著重要的作用。本研究顯示，4周齡組比12月齡組的神經元細胞個數多，Bcl-2蛋白在4周齡組C57BL/6J小鼠聽皮層神經元組織中的表達較12月齡組多。在聽皮層神經元細胞中，轉染miR-34a促表達試劑后，能增加下游Bcl-2蛋白翻譯水平的表達。

綜上，Bcl-2在不同年齡C57BL/6J小鼠聽皮層神經元中存在差異表達，通過靶向調控神經元細胞miR-34a從而影響Bcl-2表達可能成為年齡相關性聾中樞發病的機制之一。