百里醌對HUVECs細胞凋亡的影響及其機制

周瑜 李家富 馮健

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

動脈粥樣硬化(AS) 是缺血性心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是導(dǎo)致死亡的主要疾病之一〔1〕。血管內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生和AS及血栓形成存在密切聯(lián)系〔2〕，研究發(fā)現(xiàn)自噬在心血管凋亡中發(fā)揮重要功能，自噬功能受損時垃圾蛋白和缺陷性細胞器持續(xù)性積累導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生〔3，4〕。百里醌能通過抗凋亡和抗氧化應(yīng)激保護嗎啡對腎臟的毒害作用〔5〕，前期研究表明百里醌能夠激活鱗狀細胞癌自噬〔6〕，本研究旨在證實百里醌通過調(diào)節(jié)自噬參與對心血管疾病的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購于中國科學(xué)院昆明細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。百里醌、過氧化氫和選擇性磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑(3-MA)購自美國Sigma-Aldrich公司，自噬雙標(biāo)腺病毒(GFP-LC3)購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶雙標(biāo)記細胞凋亡檢測試劑盒購自廣州達博生物有限公司，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、人抑癌基因(Beclin1)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3/活化的(Cleaved)Caspase-3購自美國CST公司，自噬相關(guān)基因(LC3)-Ⅰ/LC3-Ⅱ購自美國abcam公司，β-actin抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基，加入100 μg/ml青霉素和鏈霉素(Sigma，USA)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。每2～3 d換液，每4～5 d胰蛋白酶消化離心后傳代。使用百里醌處理HUVECs細胞24 h，然后加入800 μmol/L過氧化氫處理1 h。根據(jù)百里醌濃度的不同將細胞分為四組，即陰性組(不加百里醌及過氧化氫)、對照組(800 μmol/L 過氧化氫)、低濃度組(10 μmol/L百里醌+800 μmol/L 過氧化氫)及高濃度組(20 μmol/L百里醌+800 μmol/L過氧化氫)；研究自噬作用時使用3-MA(1 mmol/L)和百里醌(20 μmol/L)與HUVECs細胞共培養(yǎng)24 h，加入800 μmol/L過氧化氫處理1 h，收集細胞備后續(xù)檢測，根據(jù)處理方式的不同將細胞分為：對照組(800 μmol/L過氧化氫)；陰性組(不加百里醌及過氧化氫)；百里醌組(20 μmol/L百里醌+800 μmol/L 過氧化氫)；3-MA組(1 mmol/L 3-MA+800 μmol/L 過氧化氫)；聯(lián)合組(20 μmol/L百里醌+1 mmol/L 3-MA+800 μmol/L 過氧化氫)。

1.3四甲基偶氮唑藍(MTT)方法檢測細胞增殖能力 將生長到對數(shù)期的HUVECs細胞用0.25%胰蛋白酶消化收集于離心管，用4 ml含10%胎牛血清培養(yǎng)基制成細胞懸液并細胞計數(shù)，按每孔8 000個細胞接種于96孔板，每孔200 μl置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h，去掉上清液，陰性組、對照組、低濃度組、高濃度組均設(shè)置5個副孔，去上清液，每孔加入含10% MTT液的DMEM培養(yǎng)基200 μl，再次置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。去上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀(OD=490 nm)處測定各孔的OD值，做出細胞生長曲線。

1.4GFP-LC3熒光檢測細胞自噬水平 GFP-LC3預(yù)實驗感染確定HUVECs細胞感染復(fù)數(shù)(MOI)值為50，調(diào)整細胞密度將HUVECs細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前用DMEM培養(yǎng)液清洗細胞，使用完全培養(yǎng)基稀釋聚凝胺至終濃度50 μg/ml，細胞加入5 μg/ml的聚凝胺和相應(yīng)體積病毒轉(zhuǎn)染HUVECs細胞，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白表達。胰酶消化離心，調(diào)整細胞密度為20×104/ml，24孔板中加入細胞爬片，每孔加入2×104細胞，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁，按1.2方法處理細胞，取出爬片用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入4%多聚甲醛固定，PBS清洗后加入DAPI染色，應(yīng)用封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞爬片。

1.5流式細胞儀分析細胞凋亡 6孔板接種細胞，每孔接種1×105細胞培養(yǎng)過夜，按1.2方法處理細胞，胰酶消化離心收集細胞，800 r/min離心5 min并用PBS清洗細胞2次，加入250 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106/ml，取100 μl細胞懸液放置于5 ml流式管中，管內(nèi)加入5 μl Annexin V-FITC(150 mg/L)和10 μl碘化丙錠(120 mg/L)并混勻，室溫條件下避光孵育15 min，加入400 μl PBS，應(yīng)用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 細胞胰蛋白酶消化離心后傳代，種于6孔板內(nèi)，待細胞貼壁后按1.2方法處理細胞。取出并棄去上清，用PBS沖洗3次加入細胞裂解液，冰上靜置1 min后刮下裂解物并轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白。留取5 μl定量，其余加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，用110 V電壓2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜上。50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h后，將膜置于特定一抗，4℃搖床上孵育過夜。次日使用TBST洗膜液10 min/次洗3次并置于相應(yīng)的二抗，常溫搖床慢速孵育1 h，10 min/次洗3次后使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液進行顯影，目的蛋白表達量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對比值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡 對照組細胞存活率顯著低于陰性組(P<0.05)，百里醌預(yù)處理可以提高細胞存活率，并隨藥物濃度加大而增強，呈現(xiàn)出濃度依賴性關(guān)系(P<0.05)；百里醌預(yù)處理后Cleaved Caspase-3蛋白水平較對照組顯著下調(diào)(P<0.05)；百里醌預(yù)處理可以降低由過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡(P<0.05)。見圖1、表1、圖2。

2.2百里醌激活HUVECs細胞自噬 低、高濃度組LC3蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)；低、高濃度組GFP-LC3蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)；見表1、圖3、圖4。

1～4：陰性組、對照組、低濃度組、高濃度組；圖3、6、7同

表1 各組細胞存活率、細胞凋亡率和Caspase-3、Cleaved Caspase-3、LC3蛋白表達及GFP-LC3比較

與陰性組比較：1)P<0.05;與對照組比較：2)P<0.05;與低濃度組比較：3)P<0.05

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

圖3 Western印跡法檢測LC3蛋白表達

圖4 百里醌激活HUVECs細胞自噬(DAPI，×200)

2.3阻斷自噬途徑百里醌對HUVECs細胞保護作用減弱 10 μmol/L和20 μmol/L百里醌預(yù)處理細胞后加入過氧化氫，應(yīng)用MTT方法檢測細胞存活率分別為(47.673±0.976)%和(68.783±7.569)%。加入3-MA阻斷自噬途徑，再使用百里醌和過氧化氫處理細胞，細胞存活率分別為(23.099±2.801)%和(34.563±3.018)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.198，P=0.000)，發(fā)現(xiàn)阻斷自噬后百里醌保護作用減弱(P<0.05)。使用Western印跡檢測Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白水平變化，結(jié)果顯示阻斷自噬后Cleaved Caspase-3蛋白水平上調(diào)且加入百里醌預(yù)處理并不能導(dǎo)致Cleaved Caspase-3蛋白水平下調(diào)。見圖5、表2。

1～5：對照組、陰性組、百里醌組、3-MA組、聯(lián)合組

表2 不同組別間Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達

2.4百里醌抑制Akt/mTOR通路和上調(diào)Beclin1蛋白激活自噬，促進Bcl-2蛋白表達抑制凋亡 與對照組相比發(fā)現(xiàn)百里醌下調(diào)p-Akt和p-mTOR蛋白表達，上調(diào)Beclin1和Bcl-2蛋白表達。見圖6、圖7、表3。

圖7 Western印跡檢測Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達

表3 各組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2蛋白表達

3 討 論

冠狀動脈性疾病是當(dāng)今社會導(dǎo)致死亡的主要疾病之一，凋亡在動脈粥樣硬化性疾病發(fā)展過程中起到重要作用，研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化組織和細胞中凋亡分子指標(biāo)明顯升高〔7，8〕。自噬作為保護機制，通過降解垃圾蛋白和缺陷性細胞器對抗細胞凋亡，然而在心血管疾病中自噬和凋亡之間的相關(guān)性仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡。MTT結(jié)果顯示百里醌預(yù)處理后加入過氧化氫能夠提高細胞生存率。Western印跡檢測凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-3表達和Annexin V-PI雙染是觀察細胞凋亡的常用方法，本研究發(fā)現(xiàn)800 μmol/L過氧化氫導(dǎo)致HUVECs細胞凋亡，而百里醌預(yù)處理后再加入過氧化氫處理細胞凋亡減少。此外，Annexin V-PI雙染可以將凋亡細胞分為早期凋亡和晚期凋亡，早期細胞凋亡的發(fā)生主要由于線粒體膜電位的變化和丟失，而晚期凋亡通常與DNA損傷有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)百里醌主要減少晚期凋亡細胞百分比，而對早期凋亡細胞影響較小，具體機制尚未可知。

為了研究自噬在百里醌保護作用中發(fā)揮的功能，本研究檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白表達。自噬發(fā)生過程中，LC3耦聯(lián)到自噬體上并LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ蛋白和LC3-Ⅰ蛋白比值變化已被用來作為自噬評價和測定的公認指標(biāo)〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)百里醌處理后LC3-Ⅱ蛋白水平升高，表明百里醌激活HUVECs細胞自噬的發(fā)生。同時本研究應(yīng)用GFP-LC3病毒檢測百里醌對自噬的影響，無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞質(zhì)中，自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。本研究中使用百里醌處理GFP-LC3腺病毒感染的HUVECs細胞發(fā)現(xiàn)綠色熒光斑點數(shù)增加，提示細胞自噬水平升高。同時為了驗證自噬是否參與百里醌降低過氧化氫引起的HUVECs細胞凋亡過程，采用3-MA阻斷自噬發(fā)生后觀察細胞增殖和凋亡情況改變，MTT結(jié)果顯示阻斷自噬后百里醌保護作用減弱，同時Western印跡結(jié)果顯示阻斷自噬后Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，表明自噬在此保護作用中發(fā)揮了重要功能。

此外，百里醌激活自噬的分子機制也是本研究的重點，既往研究發(fā)現(xiàn)百里醌通過抑制p-mTOR激活自噬，mTOR是自噬通路的經(jīng)典負性調(diào)節(jié)蛋白。在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中，常常伴隨著mTOR信號通路激活導(dǎo)致的自噬下調(diào)〔10〕。因此假設(shè)百里醌在HUVECs細胞系中通過Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬。使用Western印跡實驗檢測百里醌處理后p-Akt和p-mTOR蛋白改變，結(jié)果顯示百里醌可以抑制p-Akt和p-mTOR蛋白水平。關(guān)鍵性自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin1同凋亡途徑存在著明顯聯(lián)系〔11〕，同時Beclin1-Bcl-2復(fù)合體是自噬和凋亡相互作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究中發(fā)現(xiàn)百里醌上調(diào)Beclin1和Bcl-2蛋白表達，表明百里醌可能通過上調(diào)Beclin1激活自噬并通過上調(diào)Bcl-2發(fā)揮抗凋亡功能。

百里醌作為植物提取物，在抗腫瘤方面發(fā)揮重要功能，本研究中首次提出百里醌通過激活自噬保護血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮抗凋亡功能，對于心血管疾病的治療提供了新的思路，在未來心血管疾病治療過程中可能發(fā)揮重要作用。